Известно, что во всем мире значительную часть (более 30 %) лекарственных средств, многие ароматические вещества, пищевые добавки, красители и другие ценные вещества производят из природного растительного сырья. В связи с увеличивающимся дефицитом и стоимостью этого сырья, получаемого, как правило, из экзотических, редких и исчезающих видов диких и плантационных растений, перспективным считается новый биотехнологический метод получения фитомассы. Он заключается в выращивании изолированных клеток растений в искусственных питательных средах в стерильных условиях подобно другим микроорганизмам: бактериям, дрожжам. Использование вместо интактных растений их клеточных культур имеет ряд преимуществ, среди которых радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения фитомассы, полностью свободной от поллютантов (гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и т.п.), открытие новых веществ, не синтезируемых обычно в растениях, индустриализация и удешевление производства, возможность управления процессом биосинтеза целевых продуктов и пр. Однако в мире известны лишь единичные, хотя и очень эффективные, примеры производства препаратов из биологически активных веществ, получаемых в культуре клеток растений, из-за отсутствия достаточно эффективных технологий.
Разработке такой технологии, базирующейся на глубинном культивировании клеток растений в биореакторах большой единичной мощности, посвятили многие годы своей деятельности сотрудники нашей организации - АООТ "Биохиммаш" - в сотрудничестве с ведущими специалистами ряда научно-исследовательских, проектно-конструкторских, производственных и медицинских учреждений. Проведены научные исследования, позволившие установить критерии и параметры масштабирования процесса культивирования клеток от колб в лаборатории к производственным биореакторам. Выполнены опытно-конструкторские разработки, в результате которых сконструирован ряд биореакторов с механическим перемешиванием вместимостью до 2500 л для культивирования клеток тканей с обеспечением условий тепло - и массопереноса, асептичности, дистанционности управления. Проведены проектно-монтажные работы, благодаря которым смонтированы линии культивирования клеток с этими биореакторами на нескольких предприятиях биотехнологической отрасли и монтируются линии на опытных участках некоторых научных учреждений. На предприятиях, где были смонтированы линии культивирования клеток, испытывали и отрабатывали технологию крупномасштабного производства биомассы экономически и социально значимых культур клеток растений, установленных учеными. Главное, было установлено, что по выходу биомассы и содержанию в ней целевых продуктов культуры в биореакторах большого объема не уступают лабораторным культурам объемом в несколько миллилитров, которые до этого использовались в нашей стране даже в заводских условиях, а себестоимость производства, как и следовало ожидать, значительно ниже.
Одной из первых была разработана опытно-промышленная технология культивирования клеток женьшеня.
С античных времен женьшень рассматривают как одно из наиболее ценных, важных, хорошо знакомых народных природных медицинских средств и пищевых добавок, используемых тысячи лет в Корее, Китае, Японии и позднее в других странах мира. Женьшень считают укрепляющим средством или лекарством долговечности и "эликсиром жизни", панацеей, и относят к новому классу соединений, известных как адаптогены или антистрессорные агенты. Женьшень применяют при лечении многих расстройств, так как его разнообразные компоненты обладают многими физиологическими воздействиями. За последние 100 лет опубликовано более двух тысяч научных статей о фармакологической эффективности препаратов женьшеня.
Из нескольких видов женьшеня наиболее известным и ценным является женьшень настоящий, Panax ginseng C.A. Meyer (семейство аралиевых). Это лекарственное растение произрастает диким образом в лесах от Кореи до Восточной Сибири, включая Северо-восточный Китай и частично Японию. Так как дикорастущее растение очень редко, для массового получения корней женьшень культивируют на плантациях в Китае, Японии, Корее, Северной Америке, а также в России и других странах. Однако культивирование женьшеня на плантациях вызывает много проблем. Это объясняется длительностью и чрезвычайной трудоемкостью выращивания женьшеня: высокими требованиями к почве, климату и агротехнике. Наблюдается большое число заболеваний корня женьшеня (около 30 видов заболеваний), которыми поражены плантации женьшеня.
Между тем высокая ценность женьшеня как полезного лекарственного средства ведет к значительному увеличению его потребления в последние годы, в том числе в западных странах. Этим обусловлено резкое повышение интереса в мире к изучению возможности получения активных ингредиентов женьшеня (тритерпеновых гликозидов, полиацетиленов и др.) в культуре клеток.
Ученые России были пионерами по введению женьшеня в культуру in vitro в мире (Институт физиологии растений им. К.А.. Тимирязева РАН и др.). Академиком Р.Г. Бутенко с сотрудниками еще в 1957 году были начаты работы по получению культуры тканей и клеток женьшеня, созданию различных штаммов и линий культур клеток этого растения, всестороннему изучению этого нового биологического объекта. Приоритет промышленного получения биомассы культуры клеток женьшеня также принадлежит России (1970-1980 г.г.). Вначале на заводах работали с культурой в сосудах небольшого объема на агаровой среде, после чего стали осваивать культивирование в биореакторах, упомянутых выше. Получаемую биомассу широко использовали для коммерческого производства парфюмерно-косметических изделий, безалкогольных тонизирующих напитков, кондитерских и кулинарных изделий, продуктов диетического питания, настоек и таблеток адаптогенного действия и др. Показано, что экстракт из клеток женьшеня обладает радиопротекторным, иммуностимулирующим и другими эффектами.
В настоящее время на основе биологически активных компонентов (т.н. гинзенозидов) из культуры клеток женьшеня разрабатывается новое перспективное лекарственное средство для восстановления нарушений центральной нервной системы и психических функций. Сделано сообщение об исследовании антиэпилептических свойств этого препарата на YII Международном Симпозиуме в Корее в 2000 г.
Эта разработка, осуществляемая на базе фундаментальных исследований российских (МГУ им. М.В. Ломоносова) и корейских ученых, стала реальной благодаря созданию адекватной промышленной технологии производства биомассы женьшеня. Для возможного производства препарата клеточная биомасса должна содержать достаточное количество биологически активных компонентов - гинзенозидов.
В АООТ "Биохиммаш" совместно с сотрудниками Института биоорганической химии ДВО РАН получен и запатентован новый штамм клеток из корня женьшеня Приморской популяции. Содержание гинзенозидов в каллусной биомассе может достигать 2,5%, что не ниже, чем в растениях (максимально - до 2,4 %, в среднем - 0,3 - 1 %). Предстоит разработка опытно-промышленной технологии его производства.
Природный биологически активный нафтохинон - шиконин и его различные производные, как известно, используются в различных частях мира в качестве антимикробных, противовоспалительных и противоопухолевых медицинских средств. Шиконин применяют для лечения ожогов, ран, обморожений, кожных язв, геморроев, в качестве адъюнкта в глазной хирургии. Он обладает противодизентерийной и гонадотропной активностями, является аналогом витамина Р. Темно-пурпуровый натуральный пигмент шиконин используется в цветной губной помаде и другой косметике.
Шиконин представляет собой активное начало корней растений семейства бурачниковых, и его традиционно получают экстрагированием из корней воробейника краснокорневого, многолетнего растения, произрастающего в Японии, Корее, Китае, России (на Дальнем Востоке). Наибольшее количество шиконина к концу 20-го века потребляет Япония. Несмотря на большую потребность в шиконине, снабжение корнями воробейника краснокорневого становилось с каждым годом все затруднительнее из-за исчерпания диких растений и трудности агротехнического культивирования. В этой обстановке японские исследователи разработали и реализовали впервые крупномасштабную систему с 750-литровым биореактором для культивирования корневых клеток воробейника краснокорневого как независимый, дешевый и надежный источник шиконина. Шиконин, полученный этим индустриальным способом, был коммерчески использован для производства таких косметических изделий, как губная помада, лосьон, моющее средство и др.
Культуры клеток, продуцирующие шиконин, исследовались и в других странах: Корее, Китае, России. При исследовании сырьевой базы шиконина в СССР он был обнаружен в корнях ряда (более 10) видов растений семейства бурачниковых, произрастающих на территории этой страны. Однако было установлено, что ни один из этих видов, а тем более воробейник краснокорневой, не могут служить источником промышленного получения шиконина. Наибольшими преимуществами среди новых источников растительного сырья, как полагали, обладает макротомия красящая - эндемическое растение гор Средней Азии и Юго-восточного Казахстана. Однако обширный ареал заготовки сырья этого растения в настоящее время потерял свое значение для России. К концу 80-х годов исследования с нафтохиноновыми препаратами в России проводились в основном с использованием шиконина и его производных, полученных в культуре клеток растений. В институтах Дальневосточного отделения Российской Академии наук получен отечественный высокопродуктивный клеточный штамм редкого растения воробейник краснокорневой. На основе эфиров шиконина была разработана новая лекарственная форма эффективного нестероидного противовоспалительного средства "Шикониновое масло". Во Всесоюзном научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений установлен еще один клеточный штамм растения макротомия (арнебия) красящая - новый продуцент шиконина. С использованием шиконина, полученного в клеточной культуре в НТЦ "Риза", разработаны ряд кремов для кожи и новый перевязочный материал для ран, названный "Гешиспон". Клинические испытания показали эффективность "Гешиспона" при обработке чистых и инфицированных ран, ожогов, язв, пролежней и незаживающих ран.
На основе шиконина, произведенного в кристаллическом виде на заводской установке, совместно с ВНИИ СДВ была разработана, прошла клинические испытания и рекомендована к промышленному выпуску губная помада лечебно-профилактического действия. Эта помада с 0,3% шиконина, имея хорошие косметические свойства, обладает также устойчивой антимикробной активностью в отношении золотистого стафилококка, вызывает эпителизацию трещин, исчезновение сухости губ.
В Институте общей хирургии им. А.А. Вишневского разрабатывались биологически активные перевязочные средства с шиконином (коллагеновая губка, гели на основе полимеров) для оказания первой медицинской помощи при травмах (огнестрельных, ожоговых и др.), несколько видов антимикробных изделий санитарно-гигиенического назначения с шиконином, обладающих лечебно-профилактическим эффектом (тампоны, салфетки, платки, белье и др.).
В настоящее время завершается полный цикл создания нового препарата - мази на полиэтиленоксидной основе с 0,05 % шиконина под условным названием "Эритроризан" для терапии кожи. Препарат обладает антимикробной активностью в отношении патогенных бактерий, патогенных мицелиальных грибов, дрожжеподобных грибов. Активен в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. Рекомендуется для лечения гнойных ран в первой фазе раневого процесса, длительно незаживающих ран различного генеза, трофических язв, пролежней, дерматофитий. Благодаря тому, что шиконин обладает одновременно фунгицидным, бактерицидным и противовоспалительным эффектом, исключается необходимость применения других препаратов при лечении грибковых заболеваний кожи, осложненных бактерицидной флорой.
Проведенный к настоящему времени этап клинических испытаний препарата показал, что он обладает антимикотическим, противовоспалительным, эпителизирующим и кератолитическим эффектом и может быть использован в качестве антимикотического и антимикробного средства для лечения эпидермофитий и эпидермитов. Возможно, будет создаваться коммерческое производство этого препарата. Для этого предусматривается разработка экономически эффективной, оптимизированной крупномасштабной технологии производства шиконина в биореакторах.
За последние годы из-за прекращения поставки импортного сырья снят с производства или вновь не поставлен на него ряд препаратов. На лабораторном уровне отечественными учеными подготовлена замена некоторых из них препаратами, иногда лучшими, из культуры клеток растений. Примерами являются препараты берберин сульфат из клеток василистника малого для лечения дискинезии желчных путей, стефаглабрина сульфата из клеток стефании гладкой для лечения ряда заболеваний периферической нервной системы и многие другие. Используя имеющийся задел авторов этих разработок, а также производственную базу и опыт нашей организации в разработке технологии крупномасштабного суспензионного культивирования клеток, составлении всей необходимый нормативно-технической документации, возможна в короткий срок подготовка к производству ряда экономически и социально важных принципиально новых или воспроизводимых препаратов с относительно небольшими затратами.
Нынешние экономические условия предъявляют весьма жесткие требования к стоимости производства, которым могут соответствовать далеко не многие продукты. Таким образом, разработанная простейшая технология суспензионного культивирования клеток растений требует еще дальнейшего совершенствования. И пути его намечаются. Но это очень важные и сложные проблемы, которые нужно и интересно решать.