Аккумуляция рекомбинантного суперсладкого белка thaumatin II в апопласте трансгенных растений табака
Пушин1,2 А.С., Шестибратов2 К.А., Овчинникова2 Е.В., Шульга1 О.А., Фирсов2 А.П., Долгов1,2 С.В.
1Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН, Москва, Россия
2Филиал института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН, г. Пущино, Россия
Введение
Thaumatin II, выделенный из плодов западно-африканского растения Thaumatococcus daniellii Benth, является суперсладким белком (1). Молекулярная масса белка 22кДа, третичная структура стабилизирована 8 дисульфидными связями. Белок обладает сладким вкусом, причем пороговая концентрация в 100000 раз ниже, чем у сахарозы в молярном соотношении, и в несколько тысяч раз - в пересчете на массу (1). Сегодня тауматин находит применение в пищевой промышленности, к примеру, для придания интенсивного сладкого вкуса, легкого привкуса или изменения вкусовых оттенков. Однако в виду того, что тауматин можно выделить из плодов растения, которое плодоносит только в условиях тропического леса, для производства в промышленных масштабах возможно использование только рекомбинантного белка. Существует несколько работ по созданию экспрессионной системы для наработки рекомбинантного тауматина (2). Данный белок экспрессировали в E. coli, S. lividans, S. cerevisiae and K. lactis, однако уровень экспрессии был низким, и белок не обладал сладким вкусом. Наиболее хорошие результаты были получены в работах с использованием нитчатых грибов. Однако, при всей своей привлекательности, для наработки рекомбинантного тауматина в промышленном масштабе такие экспрессионные системы оказываются экономически не выгодными. В этом отношении наиболее привлекательными являются растительные экспрессионные системы. В данной работе нами был сконструирован химерный ген lrth, кодирующий рекомбинантный предшественник белка thaumatin II, с целью оценить возможность наработки рекомбинантного белка в растениях табака - модельной растительной культуре.
Материалы и методы
В работе использовали растения Nicotiana tabacum L. сорта. Petite Havana SR1. Химерный ген lrth и содержащий его бинарный вектор pGD121lrTh сконструировали, используя методы молекулярного клонирования, описанные Sambrook и Russell (3). Бинарный вектор pBIThau35 с нативным геном thauII был сконструирован ранее (5). Оба вектора переносили в агробактериальный штамм CBE21 по методике описанной An (4). Бактериальные штаммы, содержащие вышеперечисленные векторы, использовали для трансформации листовых дисков Nicotiana tabacum согласно методике Horsch (6). Тотальную РНК выделяли из листьев табака по методике описанной Gehrig (7) с некоторыми модификациями. Тотальные и апопластные белковые экстракты получали из листьев табака как описано у Ziegler (8) с некоторыми модификациями. Экстракты тотального белка и белка из апопласта, выделенные из тестируемых линий табака, подвергали SDS электрофорезу в 15% ПААГ по Laemmly (9). После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham). Для иммуноблоттинга в качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к белку thaumatin II в разведении 1:4000. В качестве вторичных антител использовали антикроличий IgG в разведении 1:5000, конъюгированный с флуоресцентной меткой CY3. Визуализацию мембран проводили на установке Variable Mode Imager Typhoon 9200 (Molecular Dynamics, USA). В качестве положительного контроля использовали коммерческий thaumatin II (Sigma). Анализ на сладкий вкус проводили согласно методике описанной у Witty и Harvey (10) с модификациями. Для этих анализов использовали листья табака однонедельного возраста. Анализ повторяли три раза.
Результаты и обсуждения
Для достижения эффективной аккумуляции биологически активного рекомбинантного тауматина II в апопласте трансгенных растений табака нами был сконструирован химерный ген lrth. Ген кодирует рекомбинантный предшественник белка thaumatin II. Этот предшественник состоит из N-концевой сигнальный последовательности редечного дефензина RS-AP и последовательности, кодирующей зрелую форму тауматина. (Рис. 1 А). В качестве лидерного пептида нами выбран N-концевой сигнальный пептид белка RS-AP, использующийся как сигнал для секреции белка в растениях (11). В процессе трансформации растений табака было получено 12 регенерантов с геном thauII и 16 с геном lrth. Все трансгенные растения имели нормальный фенотип. Для дальнейшей работы были произвольно выбраны 3 трансгенных линии thauII и 4 линии lrth. Тотальную РНК для ОП-ПЦР анализа выделяли из тепличных трансгенных и не трансгенных растений. Результаты ОТ-ПЦР анализа показали наличие одного продукта реакции размером 454 п.о., что соответствует фрагменту кДНК, кодирующей зрелый thaumatin II. Полоса наблюдалась во всех трансгенных линиях кроме линии TH10A (данные не приведены). Так же ОТ-ПЦР анализом мы показали, что пре-мРНК, транскрибируемая c интронсодержащего гена lrth, подвергалась сплайсингу. Секвенирование кДНК этого гена показало, что вырезание редечного интрона длинной 91п.о. в трансгенных растениях табака проходит корректно (данные не приведены). Иммуноблоттинг экстрактов тотального белка выделенного из выбранных трансгенных линий показал наличие специфичного сигнала между 20 и 25 кДа (Рис. 1 B), что не наблюдалось в экстрактах полученных из трансгенной линии TH10A и не трансгенных растений. Субклеточную локализацию рекомбинантных белков LRTH и THAUII определяли следующим образом. Из листьев трансгенных линий табака, экспрессирующих тауматин II, мы получали вытяжку межклеточной жидкости. Из оставшейся ткани выделяли тотальный белок, и далее анализировали. Данные иммуноблоттинга показали, что у трансгенных растений, содержащих ген дикого типа thauII, тауматин накапливался внутри клетки. Напротив, у растений трансформированных геном lrth, тауматин в большей степени детектировался в вытяжке из межклетников (Рис. 1 С,D). Очевидно, что удаление шести C-концевых а.к. остатков у предшественника тауматина II и замена N-концевого сигнального пептида обеспечивает секрецию тауматина в апопласт. Определение биологической активности рекомбинантного тауматина, методом органолептического анализа, показало, что линии TH1A, TH7A, LRTH1A, -4B, -6A, -7B имели сладковатый вкус, который не детектировался (ощущался) в контроле и линии без экспрессии тауматина TH10A. Тот факт, что трансгенные линии табака, аккумулирующие секреторный тауматин и линии с экспрессией тауматина II дикого типа, имели одинаковый сладковатый вкус, говорит о сохранении нативной комформации у рекомбинантного тауматина. По нашим данным, аккумуляция биологически активного тауматина II в апопласте трансгенных растений показана впервые.
Рисунок 1: (A) Нуклеотидная и соответствующая ей а.к. последовательность химерного гена lrth. Ген кодирует зрелую форму белка thaumatin II и N-концевой сигнальный пептид редечного дефензина RS-AP. Пептид выделен серым цветом, последовательность интрона выделена подчеркиванием. Стрелкой указан предполагаемый сайт протеолиза. (B,C,D) Данные иммуноблоттинга белковых экстрактов табака. TH1A, -7A, -10A и LRTH1A, -4B, -6A, -7B - трансгенные линии табака несущие ген thauII и lrth соответственно. (B) Экстракт тотального белка, 100 мкг белка на трек; (C) экстракт белка из апопласта, 7 мкг белка на трек; (D) экстракт тотального белка из остаточной ткани, 100 мкг белка на трек.
Литература
1. Van der Wel, H., Loeve, K. (1972) Eur.J.Biochem. 31, 221-225.
2. Faus, I., (2000) Appl. Microbiol. Biotech. 53, 145-151.
3. Sambrook J., Russell D.W.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. V.1-2.
4. An G., et al.: Plant Molecular Biology Manual (1988), Dordrecht: Kluwer Academic publisher, pp. A3/1-A3/19.
5. Schestibratov, K.A., Dolgov, S.V. (2005) Sci. Hort. 106(2), 177-189.
6. Horsch R.B., et al. (1985) Science 227, 1229–1231.
7. Gehrig, H.H., et al. (2000) Plant Mol. Biol. Rep. 18, 369-376.
8. Ziegler M.T., Thomas S.R., Danna K.J. (2000) Molecular Breeding 6, 37–46.
9. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.
10. Witty M., Harvey W.J. (1990) NZ. J. Crop Hort. Sci. 18, 77-80.
11. Terras, F.R.G., et al. (1995) Plant Cell 7, 573-588.