Биотехнология получения in vitro гибридов яровой мягкой пшеницы с закрепленным гетерозисным эффектом

 

Н.Н.Круглова, Институт биологии Уфимского НЦ РАН, Уфа.

 

Т.Б.Батыгина, Ботанический институт им. В.Л.Комарова РАН, Санкт-Петербург.

 

Разработана биотехнологии стабильного получения и тиражирования андроклинных гибридных растений яровой мягкой пшеницы с закрепленным гетерозисным  эффектом, основанная на использовании  клеточно-инженерного метода культуры in vitro изолированных пыльников с привлечением данных эмбриологии растений. Анализируются конкурентные преимущества разработанной биотехнологии.

 

Введение

Пыльник представляет собой фертильную часть тычинки, в гнездах которого клетки так называемой спорогенной ткани формируют микроспороциты, которые претерпевают мейотические деления и дают начало гаплоидным микроспорам. Микроспоры прорастают в пыльцевые зерна – мужские гаметофиты.

Однако в строго определенных контролируемых условиях культуры in vitro, как правило, под действием стрессовых факторов можно изменить программу развития микроспоры - той клетки пыльника, которая в природных условиях дает начало пыльцевому зерну. Иначе говоря, в экспериментальной системе культуры in vitro такая клетка на определенной стадии своего развития способна (морфогенетически компетентна) к смене программы развития с обычной гаметофитной на спорофитную, ведущую к формированию гаплоидного растения-спорофита. Репродукция растений в данном случае проходит по схеме: спорофит à спорофит.

Явление формирования спорофита в условиях культуры in vitro из морфогенетически компетентной клетки пыльника было открыто в 1964 г. на примере растений дурмана Datura L. [Guha, Maheshwari, 1964]. Открытие этого явления можно считать одним из самых значительных в биологии растений за последние годы. Процесс образования гаплоидного растения-спорофита из морфогенетически компетентной клетки пыльника в культуре in vitro получил название «андроклиния» (от греч. ανδρος – мужской, κλινος – имеющий склонность). В западной литературе широко распространен термин «андрогенез in vitro».

Таким образом, суть интереснейшего феномена андроклинии состоит в переключении программы развития морфогенетически компетентной гаплоидной клетки-микроспоры с обычного гаметофитного пути (образование пыльцевого зерна) на иной путь – спорофитный (образование гаплоидного растения).

 

Конкурентные преимущества биотехнологии получения андроклинных растений

Биологический феномен андроклинии лежит в основе метода культуры in vitro изолированных пыльников – уникального биотехнологического приема, перспективного в современных генетико-селекционных исследованиях растений. Уникальность этого метода состоит в том, что на сегодняшний день это единственный способ закрепить ценный гетерозисный эффект гибридов 1-го поколения.

Конкурентные преимущества данной технологии состоят в получении за сравнительно короткое время гомозиготных константных гаплоидных гибридов 1–го поколения, сохраняющих в генотипе хозяйственно-ценные признаки родительских форм. Такие гибриды чрезвычайно важны в современной сельскохозяйственной практике.

Использование гаплоидных гибридов значительно облегчает и отбор ценных генотипов, возникающих в результате рекомбинации генетических данных родительских форм. Такой отбор дает возможность ускорить оценку перспективности полученных гибридов.

Перевод гаплоидов в дигаплоидное состояние позволяет получать полноценные семена таких растений.

 

Особенности разработанной биотехнологии получения андроклинных растений яровой мягкой пшеницы

В лаборатории генетики и цитологии растений Института биологии Уфимского НЦ РАН в творческом содружестве с лабораторией эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН (г. Санкт-Петербург) разработан лабораторный образец биотехнологии стабильного массового получения в культуре in vitro хозяйственно ценных и конкурентно способных гибридных дигаплоидных растений яровой мягкой пшеницы с закрепленным гетерозисным эффектом. Особенности данной разработки заключаются в использовании клеточно-инженерного метода культуры in vitro изолированных пыльников, а также данных эмбриологии, цитологии, гистологии и физиологии растений. Всё это ведет к максимально полной реализации морфогенетического потенциала инициальных клеток андроклинии в условиях культуры in vitro.

Экспериментально выявлено, что инициальными клетками андроклинии у яровой мягкой пшеницы являются микроспоры в сильновакуолизированной фазе (по периодизации [Круглова, 1999, 2001]). Способность к переключению программы развития сильновакуолизированной микроспоры с гаметофитной на спорофитную определяется, по нашему мнению, рядом моментов. Первое. Особенность структурной организации этой клетки: наличие хорошо развитой центральной вакуоли и крупного ядра, расположенного противоположно поре прорастания. Тем самым сильновакуолизированная микроспора характеризуется хорошо выраженной полярностью (апикально-базальной организацией). Следует отметить, что по этому признаку сильновакуолизированная микроспора структурно сходна со зрелой яйцеклеткой большинства цветковых растений. Это свидетельствует о существовании принципиального сходства в организации инициальных клеток нового индивиддуума при различных системах репродукции, как в естественных условиях, так и в культуре in vitro. Второе. Активные процессы метаболизма сильновакуолизированной микроспоры, что подтверждается данными ультраструктурного анализа. Все эти обстоятельства характеризуют сильновакуолизированную микроспору как чрезвычайно активную клетку.

Фенотипические признаки донорных растений яровой мягкой пшеницы, содержащих пыльники с сильновакуолизированными микроспорами, таковы: кончик колоса, находящегося в листовой обертке, располагается строго на ¹/₄  расстояния от основания флагового листа до основания предпоследнего снизу листа (VII этап органогенеза). Такие фенотипические признаки служат морфологическими маркерами для экспресс-диагностики донорных растений и, тем самым, оптимизации процесса получения гаплоидов.

В результате экспериментальных исследований установлено, что индукции андроклинии способствует стрессовое воздействие холодом в эмпирически выявленном режиме (+4⁰С, 7 сут) на пыльники перед их размещением на питательной среде in vitro. Каков механизм действия холода? Экспериментально установлено, что холод провоцирует «отрыв» сильновакуолизированных микроспор от стенки пыльника. Такой отрыв приводит к нарушению целостности пыльника как системы, нарушению морфогенетических корреляций между тканями стенки пыльника и сильновакуолизированными микроспорами и тем самым нарушению детерминации нормального развития пыльцевого зерна. Кроме того, отрыв приводит к изменению структурной организации микроспоры (нарушению ее полярности) и к изменениям стенки пыльника (ее дегенерация). Таким образом, стрессовое воздействие холодом в определенном режиме является триггером спорофитного пути морфогенеза сильновакуолизированных микроспор в культуре in vitro.

После холодовой предобработки пыльники инокулировали в условия in vitro на индукционную питательную среду Potato II [Chuang, Ouyang, 1978] в собственной модификации [Круглова, Батыгина, 2002, 2006]. В условиях культуры in vitro морфогенез сильновакуолизированных микроспор проходит различными путями. Биотехнологов, естественно, интересует тот путь морфогенеза, который ведет к формированию полноценных плодоносящих растений. Выявлено, что оптимальным путем морфогенеза в данном случае является эмбриоидогенез, состоящий в формировании из микроспоры эмбриоида (греч. εμβρυον – зародыш, ειδος – образ) – зародышеподобной структуры (синонимы: соматический зародыш, адвентивный зародыш).

Установлено, что индукция формирования эмбриоида определяется балансом между концентрацией экзогенного ауксина 2,4-Д в модифицированной индукционной питательной среде Potato II и содержанием эндогенного ауксина ИУК в пыльнике в момент инокуляции. Для каждого сорта или гибридной линий пшеницы такой баланс будет своим. Подбор такого баланса как методический подход позволяет управлять процессом морфогенеза сильновакуолизированных микроспор в культуре in vitro и способствует ускорению биотехнологии получения андроклинных растений яровой мягкой пшеницы.

На основании детальных эмбриологических, цитологических и гистологических данных а также морфологических наблюдений установлены этапы развития инициальной сильновакуолизированной микроспоры до сформированного эмбриоида на индукционной питательной среде Potato II. Показано, что развитие микроспориального эмбриоида in vitro принципиально сходно с развитием зиготического зародыша в естественных условиях.

Сформированные эмбриоиды переносили на среду для регенерации, составленную по прописи [Blaydes, 1966] в собственной модификации [Круглова, Батыгина, 2002, 2006]. Полученные андроклинные растения выращивали в пробирках до фенофазы кущения. Далее растения извлекали из пробирок и с помощью цитогенетического контроля отбирали только гаплоидные особи. Их обрабатывали смесью для дигаплоидизации (состав смеси является know how). После цитогенетического контроля дигаплоидизированные андроклинные растения переносили в почву, где они развивались до фенофазы полной спелости зерна.

Лабораторная и полевая оценка показала высокую всхожесть полученных семян андроклинных растений. Качество семян подтверждено данными эмбриологического анализа.

 

Заключение

Биотехнологический метод получения полноценных фертильных андроклинных дигаплоидных растений яровой мягкой пшеницы – сложный процесс, зависящий от комплекса разнообразных факторов. Однако уже сейчас арсенал теоретических и экспериментальных данных позволяет сделать этот процесс управляемым и получать полноценные конкурентно способные андроклинные растения с закрепленным гетерозисным эффектом для внедрения их в селекционную практику. Полноценные семена позволяют тиражировать полученные андроклинные растения.

Область применения разработанной биотехнологии – выведение новых районированных сортов яровой мягкой пшеницы с хозяйственно–ценными показателями.

Принципиальные особенности данной биотехнологии защищены рядом авторских свидетельств. Авторами опубликованы методические рекомендации по использованию этой биотехнологии [Круглова, Батыгина, 2002, 2006].

Лабораторный образец данной биотехнологии прошел успешную апробацию в полевых условиях Селекционного центра Башкирского научно-исследовательского института сельского хозяйства РАСХН (г. Уфа) при творческом содружестве с лабораторией селекции яровой пшеницы этого института.

Исследования поддержаны РФФИ (гранты № 99-04-48002, № 99-04-48496, № 00-15-97828, № 01-04-06565, № 02-04-48701, № 02-04-49807, № 02-04-06132, № 03-04-06213, № 05-04-97911, № 05-04-08114), программой «Интеграция» (гранты ЯО 128/1644 и Ц004), программой «Ведущие научные школы Российской Федерации» (гранты № НШ 2148.2003.4 и № НШ 4834.2006.4).