Полиморфизм ДНК различных видов клопов по RAPD-маркерам

 

Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я.

ВНИИ биологической защиты растений (Краснодар)

 

В работе приведены результаты RAPD-анализа девяти различных видов клопов, принадлежащих к разным родам и семействам. Молекулярно-генетический полиморфизм насекомых изучен по двум праймерам (ОРА06 и GT09). По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК-фрагментам (58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ. Все 127 особей четко распределились в отдельные кластеры, в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в отдельную группу выделились клопы-щитники (Pentatomidae), куда попали и представители вида Eurygaster integriceps (Scutelleridae).  Генетическое сходство клопов-черепашек с  другими представителям семейства Pentatomidae, по-видимому, указывает на то, что эти клопы относится скорее  к Pentatomidae, чем к Scutelleridae.

Молекулярно-генетический анализ насекомых в последнее время используется для изучения различных популяционных процессов и для целей систематики. Изучение молекулярно-генетического полиморфизма популяций клопов очень малочисленны. Нам известны только две работы по оценке RAPD полиморфизма у клопов -щитников Nezara viridula (Pentatomidae) в Бразилии (Vivan e.a., 2003) и Eurygaster integriceps (Scutelleridae) в Иране (Saeedi e.a., 1999).

 Для эффективного контроля и управления численностью клопов – вредителей сельскохозяйственных культур необходимы знания о генетической изменчивости структуры популяций этих насекомых. Одним из современных методов анализа генетического полиморфизма является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и различные ее модификации, в том числе RAPD-PCR (случайным образом амплифицированная ДНК).

В задачу нашего исследования входило изучить молекулярно-генетический полиморфизм различных видов клопов – представителей разных таксонов отряда Hemiptera – с помощью метода RAPD-PCR. Клопов собирали зимой в лесополосе на территории института (ВНИИБЗР, Краснодар) в 2006 году. ДНК выделяли СТАВ-методом из целых мелких насекомых и из переднеспинки крупных особей с дополнительной обработкой препаратов РНК-полимеразой и фенолом. Объектом исследования служили от 6 до 33 особей клопов следующих видов: Graphosoma lineatum L.; Nezara viridula L.; Dolicorys  baccarum L.; Eysarcoris incospicnus h-s.; Piesodorus lituratus; Palomena prasina (Hemiptera: Pentatomidae); Pyrrhocoris apterus (Hemiptera: Pyrrhocoridae); Coreus marginatus (Hemiptera: Coreidae); Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera: Scutelleridae).

Результаты ПЦР анализа по предварительному скринингу девяти праймеров позволили отобрать два из них (ОРА06 и GT09), обладающих наибольшей информативностью и при этом наиболее воспроизводимых при разных концентрациях ДНК. Эти два праймера были использованы нами в дальнейшей работе. Результаты RAPD-анализа 127 особей исследуемых видов клопов приведены в таблице 1.

В целом по всем  изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА06 было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 – от 12 до 27. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА06 и GT09 колебалось в зависимости от вида в пределах 5,6 ¸ 11,7; и 4,2 ¸ 13,5, соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРА06) и 86,2 % (GT09). Размер продуктов амплификации варьировал от 100 до 2300 (ОРА06) и  от 170 до 2700 пар нуклеотидов (GT09).

По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК фрагментам, для обоих праймеров вместе (58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ. Все особи четко распределились в отдельные кластеры, в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в самостоятельный кластер выделились особи клопов Pyrrhocoris apterus и  Coreus marginatus, принадлежащих к семействам, отличным от  клопов-щитников (Pentatomidae). Можно было выделить, также два других больших кластера, в первый из которых входили представители видов Eurygaster integriceps. (Hemiptera: Scutelleridae); Graphosoma lineatum; Nezara viridula; и Piesodorus lituratus (Hemiptera: Pentatomidae), а во второй - Dolicorys  baccarum; Palomena prasina и Eysarcoris incospicnus (Hemiptera: Pentatomidae).

Несколько неожиданно для нас внешне сходные по морфологии виды Nezara viridula и Palomena prasina, оказались в разных кластерах, что указывает на более значительные генетические различия между этими видами, по сравнению с другими исследованными видами клопов-щитников. Кроме того, клоп-вредная черепашка Eurygaster integriceps (Scutelleridae) и представители сем. Pentatomidae,  оказались генетически очень близкими.

Канонический дискриминантный анализ в целом подтвердил результаты кластерного (рисунок 1). Генетические расстояния шести исследуемых видов клопов-щитников до центроида составляли 9,4 ¸12,7 (у клопа-вредная черепашка – 12,0), тогда как представители других семейств отстояли от центроида щитников на расстоянии 13, 9 (Coreus marginatus , сем.Coreidae) и 17,6  (Pyrrhocoris apterus, сем. Pyrrhocoridae).

Таким образом, по результатам молекулярно-генетического анализа можно заключить, что в некоторых случаях морфологически похожие друг на друга виды могут в  значительной степени генетически различаться  и в филогенетическом плане относительно далеко отстоять друг от друга. И, наоборот, выделенные в разные семейства виды, могут оказаться очень близки в генетическом плане, и иметь много общих гомологичных последовательностей ДНК в геноме. Поэтому на основании проведенных исследований нам представляется необходимость в более детальном изучении таксономической принадлежности клопа-вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. и других представителей семейства Scutelleridae.  Этот вид, по всей вероятности, скорее можно отнести к семейству Pentatomidae, о чем ранее высказывались и другие исследователи (Бей-Биенко и др., 1955).

Таблица 1 - Полиморфизм ДНК некоторых представителей отряда Hemiptera по RAPD-маркерам

№ п/п	Вид, объем выборки (n)	Праймер	Число детек-тируемых фраг- ментов	Уровень полимор-физма (%)	Размеры фраг-ментов (п.н.)	Моно-морфные фраг-менты (п.н.)	Число фраг-ментов на особь	Среднее число фраг-ментов на особь
1	Eurygaster integriceps (Scutelleridae) (Pentatomidae?)	ОРА06	26	95,7	170-1400	590	4-11	6,3
		GT 09	27	92,6	160-1700	600 320	4-14	10,3
2	Graphosoma lineatum (Pentatomidae)	ОРА06	25	92,0	150-2000	470 380	5-19	11,5
		GT 09	16	93,8	180-1080	570	2-13	6,6
3	Nezara viridula (Pentatomidae)	ОРА06	23	95,8	280-1400	650 400	2-14	7,8
		GT 09	24	87,5	200-2700	620 480 350	7-19	13,5
4	Dolicorys baccarum (Pentatomidae)	ОРА06	31	96,8	100-1700	780	6-12	8,9
		GT 09	29	100,0	170-2100	нет	4-14	9,3
5	Eysarcoris incospicnus. (Pentatomidae)	ОРА06	35	100,0	150-2300	нет	9-16	11,7
		GT 09	27	100,0	170-1700	нет	3-15	10,2
6	Piesodorus lituratus (Pentatomidae)	ОРА06	20	85,0	220-1090	590 540 470 230	6-13	10,3
		GT 09	17	88,2	180-2000	620 460	2-13	9,9
7	Palomena prasina (Pentatomidae)	ОРА06	16	87,5	490-2000	790 780	7-10	8,5
		GT 09	12	37,5	180-2300	980 700 530 320 180	7-11	8,8
8	Pyrrhocoris apterus (Pyrrhocoridae)	ОРА06	20	85,0	280-1900	1250 470 420	4-18	11,5
		GT 09	9	88,9	320-1400	750	2-7	4,2
9	Coreus marginatus (Coreidae)	ОРА06	16	93,8	260-1600	470	3-8	5,6
		GT 09	16	87,5	320-2100	800 750	4-10	6,1

 

Работа поддержана грантом РФФИ №06-04-96644