Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, п. Борок Ярославской обл.
Рассматривается возможность использования в качестве биомаркеров таких показателей иммунной системы, как мелано-макрофагальные центры иммунокомпетентных органов пресноводных костистых рыб и фагоцитарная способность нейтрофилов (по результатам НСТ-теста), сравниваются результаты НСТ-теста при экспозиции рыб in vitro и in vivo.
The fish immune system indicators (melano-macrophage centers of immunicompetence organs of freshwater teleostei and phagocytic activity of neutrophils (NBT-test)) were examined as biomarkers. Were confronted the results of experiments in vivo and in vitro.
Введение
Исследование иммунной системы рыб, как представителей низших позвоночных, представляет существенный интерес не только в плане сравнительной систематики, но и в значительной мере потому, что рыбы составляют достаточной большую долю продуктов питания человека и являются объектом рыборазведения и промысла. Кроме того, иммунная система рыб, отвечающая за защиту организма от чужеродных субстанций – достаточно чувствительный показатель состояния, как самого организма, так и среды его обитания. В этом плане исследование различных составляющих иммунной системы рыб достаточно важно для мониторинговых исследований и оценки иммунотоксичности различных соединений.
В данной работе обсуждаются вопросы использования в качестве биомаркеров таких показателей, как мелано-макрофагальные центры иммунокомпетентных органов пресноводных костистых рыб при загрязнении вод стоками промышленных предприятий и сравнение их с лабораторными экспериментами, сравнение результатов НСТ-теста при экспозиции рыб in vitro и in vivo.
Материалы и методы исследования.
Объектами исследования послужили карпы в возрасте 1+, средней массой 60 г, которых содержали в 150-литровых пластиковых аквариумах с принудительной аэрацией. 10 рыб были экспонированы в течение 14 сут в сублетальной концентрации ионов Cd2+(5 мг/л), 10 рыб послужили контролем.
Для оценки использования в качестве биомаркеров были выбраны такие показатели, как количество и структура мелано-макрофагальных центров (ММЦ) в почках и селезенке рыб, а также НСТ-тест для оценки фагоцитарной способности клеток по НСТ-тест проверяли как при отборе проб у экспонированных карпов, так и при постановке опытов in vitro с концентрациями ионов кадмия 0.01 и 0.1 мкг/л. Количество и структуру ММЦ исследовали на полутонких срезах методом световой микроскопии, результаты оценивали в программе Image tool. Все результаты подвергли статистической обработке, достоверность различий определяли по критерию Стьюдента при Р=0.05.
Результаты исследований
ММЦ
Результаты исследований показали, что через 14 сут у экспонированных карпов, как в селезенке, так и в туловищной почке отмечено разрушение 18-20% ММЦ по отношению к контролю, к тому же наблюдалась тенденция к снижению их количества. Следует отметить, что формирование оболочек вокруг ММЦ предохраняет их от разрушения. Достоверными оказались и уменьшение площадей неразрушенных ММЦ на 11% по отношению к контролю. Более информативным оказался расчет не только количества ММЦ и их площади, но и отношения площадей всех ММЦ в поле зрения на площадь поля зрения.
НСТ-тест.
Экспозиция рыб в течение 14 сут в сублетальной концентрации ионов кадмия вызвала снижение индекса спонтанной фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови рыб с 0.13 ± 0.03 в контроле до 0.07 ± 0.02 у экспонированных рыб. Индекс индуцированной фагоцитарной активности также достоверно снижался с 0.44 ± 0.03 в контроле до 0.31 ± 0.04 в опыте.
При постановке опытов in vitro испытуемую концентрацию ионов металла (0.01 и 0.1 мкг/л) добавляли непосредственно в реакционную смесь. Показания реакции образования диформазана снимали так же, как и в случае исследования опытов in vivo - через 30 мин после начала реакции. Результаты приведены в таблице:
|
Концентрация ионов кадмия |
0 (контроль) |
0.01 мг/л |
0.1 мкг/л |
|
ИАНсп |
0.13 ± 0.03 |
0.23 ± 0.03 |
0.26 ± 0.02 |
|
ИАНст |
0.44 ± 0.03 |
0.32 ± 0.04 |
0.52 ± 0.03 |
Как следует из результатов, внесение ионов металла непосредственно в реакционную смесь, более сильно влияет на реакцию образования диформазана, чем экспонирование рыб в течение длительного времени в растворе этого же металла, не смотря на то, что испытуемые концентрации на несколько порядков меньше.
Таким образом, сравнение действия ионов кадмия на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro и in vivo показало, что добавление намного меньших концентраций соли позволяет, так же, как и в опытах in vivo выявить токсичное действие металла на клетки.
Токсичное действие ионов кадмия не только на клетки, но и на ткани подтверждает и гистологическое исследование тканей, а количественно – процент повреждения ММЦ.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данных показателей в качестве биомаркеров для оценки качества среды обитания и степени токсичности различных соединений.