Ферментативная индикация токсического действия трансформации пестицидов в почве
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Россия
The possibility of indication of toxic effect and pesticides' transformation in soil by analyzing its dehydrogenase activity has been substantiated. It is suggested to use this biochemical index at ecological-geochemical estimate of novel means of plants' chemical protection applied in agriculture.
Введение
Пестициды попадают в почву различными путями (при непосредственном применении, с протравленными семенами и т.д.) и сохраняют свое исходное токсическое действие на биоту до тех пор, пока они не начинают подвергаться трансформации в безвредные вещества, главным образом под влиянием микроорганизмов. И поэтому становится важным осуществлять синхронную индикацию двух названных процессов, для того чтобы минимизировать экологический риск применения пестицидов, как химических средств защиты растений.
Анализ исследований по индикации токсического действия и трансформации пестицидов в почве показывает, что для этой цели в числе биохимических показателей часто используется ее дегидрогеназная активность, под которым понимается дегидрогеназная активность почвенной микрофлоры (Петерсон, 1967). Считается (Юровская, 1977), что дегидрогеназная активность является более чувствительным показателем, в частности, токсического действия пестицидов по сравнению с учетом количества микроорганизмов и их выживаемости.
Целью данной работы явилось обоснование возможности синхронной индикации процессов токсического действия и трансформации пестицидов в почве путем анализа ее дегидрогеназной активности. Первым шагом при решении данной проблемы явилась разработка концептуальной модели реакции дегидрогеназной активности почвы на взаимодействие пестицидов с микроорганизмами.
Концептуальная модель реакции дегидрогеназной активности почвы на взаимодействие пестицидов с микроорганизмами
Взаимодействие пестицидов с почвенными микроорганизмами выражается в форме двух основных процессов: токсического действия данных ксенобиотиков, как физиологически активных соединений на микрофлору и их микробиологической трансформации, в целом проявляемых через изменение дегидрогеназной активности почвы.
Токсическое действие пестицидов на микрофлору заключается, в нарушении механизма синтеза ею ферментов, замедлении и остановке метаболизма, задержке роста и развития и т.д., что приводит к дезорганизации клеток и их гибели (Емнова, Кодрян, 1984). Кроме того, пестициды при попадании в почву могут блокировать ферменты путем образования комплекса "пестицид-фермент" и выводить их из реакции с субстратом, нарушая тем самым определенные биохимические процессы. Последующее восстановление ферментативной активности почвы происходит за счет жизнедеятельности микроорганизмов, устойчивых к используемым дозам пестицидов. Для второго процесса характерны трансформация пестицида при использовании его микроорганизмами в качестве источника углерода и (или) азота, а также превращение ксенобиотика, связанное со стимулирующим влиянием метаболизма более доступных субстратов (косубстратов). При этом важное значение имеет наличие условий, способствующих микробиологической трансформации пестицидов, а именно: их доступность ферментам микроорганизмов, которая определяется степенью сорбции ксенобиотиков почвенными частицами и коллоидами; наличие косубстратов; влажность почвы, ее аэрация, температура и рН и др. (Головлева, Головлев, 1980).
Адекватным отражением описанного функционального состояния микрофлоры при загрязнении почвы пестицидами может стать ее дегидрогеназная активность, которая, как показали модельные опыты Масько и Потоцкой (1987) с почвой, подверженной действию стерилизующей дозы g-радиации, на 95% обусловлена ферментами живой микрофлоры.
Некоторые особенности анализа дегидрогеназной активности почвы
При анализе дегидрогеназной активности почвы изменение ее уровня, как следствие токсического действия пестицидов на микрофлору и процесса их микробиологической трансформации, будет выражаться количеством образуемого 2,3,5-трифенилформазана (ТФФ) из используемого в качестве субстрата 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (ТТХ) при акцептировании последним мобилизованного ферментом водорода (Хазиев, 1976). Считается, что дегидрогеназная активность проявляется преимущественно внутри структурных частиц почвы, т.е. в условиях недостаточного содержания кислорода (Александрова, Шмурова, 1974).
При анализе дегидрогеназной активности почвы соответствующие анаэробные условия создают либо путем откачивания воздуха из вакуумных колб с реакционной смесью (почва, CaCO3, водные растворы глюкозы и ТТХ) при разрежении 10-12 мм рт.ст. в течение 2-3 мин (Хазиев, 1976; Галстян, 1978), либо посредством использования специальных колб с боковым отростком, в который заливают щелочной раствор пирогаллола (абсорбент кислорода) перед инкубацией реакционной смеси, что значительно упрощает подготовку к ферментативному анализу (Каррер, 1962; Личко, Буйлов, 1983). В целом краткосрочность инкубирования реакционной смеси - в большинстве случаев 24 ч и относительно высокая точность анализа активности почвенной дегидрогеназы - ошибка не более 8% (Хазиев, 1976; Галстян, 1978) позволяют успешно ее использовать для целей ферментативной индикации токсического действия пестицидов на микрофлору и процесса их микробиологической трансформации в почве.
Индикация токсического действия пестицидов на микрофлору
В модельных опытах дозы пестицидов варьируют от нескольких мг до сотен и более мг на кг почвы, что не случайно, так как с одной стороны, эти количества имитируют загрязнение почвы при передозировках препаратов или их аварийных разливах, с другой стороны, они позволяют более четко выявлять токсическое действие пестицидов на дегидрогеназную активность почвы.
Результаты экспериментов, проведенных с образцами выщелоченного чернозема (Словакия), обработанными гербицидами линуроном и прометрином, а также инсектицидом ГХЦГ в дозах 5-50 мг/кг показали, что относительно более растворимый в воде и одновременно более стойкий линурон оказывал более продолжительное ингибирование дегидрогеназной активности - до 6.2 мес. по сравнению с менее растворимыми и стойкими прометрином и ГХЦГ - до 3.7-5.5 мес. (Тюрюканова и др., 1988). Это может указывать на выраженную во времени перестройку в метаболизме микробных клеток в зависимости от токсичности ксенобиотиков. Следует также отметить, что если депрессия какого-либо функционального состояния микрофлоры под действием пестицида, характеризуемое в данном случае снижением ее дегидрогеназной активности, будет продолжаться свыше 2-х месяцев, то влияние ксенобиотика оценивается как критическое.
Аналогичная зависимость была установлена в опытах Ильинской и соавт. (1985), когда более растворимый в воде прометрин в концентрациях 5-50 мг/кг подавлял дегидрогеназную активность обыкновенного чернозема, а менее растворимый атразин - только при максимальном его содержании - 50 мг/кг. Фунгицид металаксил, использованный в форме смачивающегося порошка, ингибировал дегидрогеназную активность бурозема (Словакия) только при дозе 200 мг/кг по действующему веществу, в то время как химически чистое вещество - при 50 мг/кг (Васильева и др., 1991). В том же опыте дегидрогеназная активность лугово-черноземовидной почвы (Краснодарский край) подавлялась более растворимым в воде фунгицидом - сульфатом меди уже при концентрациях 1-10 мг/кг. В наших опытах (Галиулин и др., 1986) ингибирование дегидрогеназной активности серой лесной почвы (Московская обл.), обработанной 4-хлоранилином в дозе 100 мг/кг (метаболит гербицидов монурона и монолинурона) и инкубируемой при 15оС связывалось с сохранением при этих температурных условиях существенных количеств ксенобиотика, экстрагируемого водой и токсичного для микроорганизмов. Ингибирующий эффект 4-хлоранилина убывал с дальнейшим повышением температуры инкубирования почвы до 30-45оС. Отмечаемые явления не случайны, так как токсическое влияние ксенобиотиков наиболее сильно проявляется, когда они находятся в почве в значительных количествах в водорастворимой форме.
В лабораторных условиях Донковой (1997) испытывалось действие гербицида хлорсульфурона в концентрации 0.009 мг/кг, соответствующей рекомендуемой для применения в сельскохозяйственной практике дозе и увеличенной в 10 раз на дегидрогеназную активность 3-х различных типов почв (Болгария). Как оказалось, наибольшее и продолжительное (60 сут.) ингибирующее влияние гербицид при обеих дозах оказывал на ферментативную активность аллювиально-луговой почвы (гумус 0.9%, рНН2О 6.0), чем на активность серой лесной почвы (гумус 2.2%, рНН2О 6.2) и особенно выщелоченной смолницы (гумус 2.6%, рНН2О 7.9). Дегидрогеназная активность аллювиально-луговой почвы составляла в период наблюдения 7-60 сут. всего 57-69 и ~29-65% контрольного уровня, соответственно при минимальной и максимальной дозах хлорсульфурона. Автор такой ингибирующий эффект гербицида объясняет относительно низкой его сорбцией данной почвой, и поэтому большей возможностью взаимодействия ксенобиотика с микроорганизмами, обусловливающих дегидрогеназную активность.
Исследования Kalam a. Mukherjee (2001) проводились с образцами почвы (рН 6.9) из рисового поля (Индия), обработанных инсекто-акарицидом этионом, фунгицидом гексаконазолом и инсектицидом карбофураном в дозах 0.5-10 мг/кг. С увеличением содержания пестицидов в почве ингибирующий эффект на ее дегидрогеназную активность возрастал. Так, через 1 нед. инкубирования почвы максимальная концентрация этиона, гексаконазола и карбофурана ингибировала активность фермента соответственно на 66, 60 и 36%. Однако ингибирующий эффект карбофурана, причем всех его доз, сохранялся в течение всего периода наблюдения (5 нед.), а этион продолжал оказывать токсическое действие только при максимальной концентрации. Что касается гексаконазола, то к концу наблюдения ингибирование постепенно сменялось на стимулирование дегидрогеназной активности почвы.
В опыте с лугово-аллювиальной почвой (Московская обл.) продолжительностью 1 нед. было установлено, что ингибирование ее дегидрогеназной активности гербицидом 2,4-Д наблюдается только при дозе 500 мг/кг (Галиулин, Галиулина, 1993). В исследованиях Semus a. Ottow (1985) c увеличением концентрации 4-хлоранилина, 3,4-дихлоранилина и 3,4,5-трихлоранилина (метаболиты различных гербицидов) от 10 до 1000 мг/кг в суглинистой почве (гумус 7.9%), ингибирование ее дегидрогеназной активности возрастало постепенно.
Индикация микробиологической трансформации пестицидов в почве
В лабораторных опытах Dinelli et al. (1998) исследование стойкости 3-х гербицидов - триасульфурона, примисульфурон метила и римсульфурона в концентрациях 0.2 и 5 мг/кг в опесчаненном суглинке (Италия) сопровождалось параллельной оценкой ее дегидрогеназной активности. Динамика последней при повышенном содержании гербицидов характеризовалась достижением максимума через определенный промежуток времени и в дальнейшем резким снижением, особенно в случае примисульфурон метила и римсульфурона. При этом время достижения максимального значения дегидрогеназной активности положительно коррелировало со стойкостью гербицида, характеризуемой временем его трансформации на 50% (Т50). Так, вышеназванный показатель составлял соответственно 15 и 25 сут. для относительно более стойких триасульфурона (Т50=30 сут.) и примисульфурон метила (Т50=26 сут.) и 3 сут. для менее стойкого римсульфурона (Т50=7.5 сут.). Можно считать, что в данном случае дегидрогеназная активность явилась прямым отражением времени адаптации микроорганизмов-деструкторов к различным гербицидам, а, следовательно, длительности трансформации последних.
Аналогичные исследования проводились с суглинистой почвой с содержанием гумуса 3.1% (США), обработанной гербицидом алахлором в дозах 10-1000 мг/кг (Felsot a. Dzantor, 1995). Было установлено, что за весь период наблюдения (3 нед.) алахлор при концентрациях 10 и 100 мг/кг трансформировался соответственно на 49 и 14%, а в количествах 250-1000 мг/кг отмечались несущественные изменения в динамике содержания гербицида. При этом дегидрогеназная активность не ингибировалась значительно при концентрациях алахлора, равных 10 и 100 мг/кг. При дозах 250 и 500 мг/кг гербицид угнетал активность фермента сразу после его внесения в почву, что в последующем восстанавливалась к концу наблюдения. Дальнейшее повышение концентрации алахлора до 750 и 1000 мг/кг приводило к существенному снижению дегидрогеназной активности почвы, составившей к концу наблюдения соответственно ~ 70 и 10 % контрольного уровня. Как видно из этих данных, чем больше содержание гербицида в почве, тем ниже скорость его трансформции, но выше ингибирующий эффект ксенобиотика на дегидрогеназную активность почвы.
Анализ динамики содержания гербицида монолинурона (Со=50 мг/кг) и его основного метаболита - 4-хлоранилина (Со=50 мг/кг) в серой лесной почве (Московская обл.) и ее дегидрогеназной активности показал снижение значений этих показателей со временем (Галиулин, Галиулина, 1990; Галиулин и др., 1991). Это значит, что по мере утилизации ксенобиотиков микробными клетками и накопления метаболитов, скорость роста микроорганизмов тормозится - культура вступает в фазу замедления роста и поэтому снижается дегидрогеназная активность почвы. Аналогичная зависимость между рассматриваемыми показателями была получена в ряде опытов: с выщелоченным черноземом (Словакия) и ГХЦГ (Со=5 мг/кг), лугово-аллювиальной почвой (Московская обл.) и 2,4-Д при концентрациях 50 и 100 мг/кг, а также с серой лесной почвой (Московская обл.) и 4-хлоранилином (Со=100 мг/кг) при 30 и 45оС (Тюрюканова и др., 1988; Галиулин и др., 1986; Галиулин, Галиулина, 1993).
Заключение
Дегидрогеназная активность почвы является четким отражением взаимодействия пестицидов с микроорганизмами, что выражается в ее адекватной реакции на токсическое действие ксенобиотиков на микрофлору и на их микробиологическую трансформацию. Дегидрогеназная активность почвы проявляет высокую чувствительность к относительно более растворимым в воде и одновременно более стойким пестицидным соединениям, зависит от их концентрации, температуры почвы, коррелирует с убылью содержания пестицидов в пределах биологического оптимума их трансформации. Данный биохимический показатель предлагается использовать при эколого-геохимической оценке внедряемых в сельское хозяйство новых средств химической защиты растений.
Работа выполнена в рамках проекта № 06-05-64109, поддержанного грантом Российского фонда фундаментальных исследований.