Ферменты и плазмиды психрофильных эубактерий Антарктиды
И. С. Андреева, О. В. Морозова *, Н. И. Печуркина, Л. И. Пучкова, И. В. Саранина,
Е. К. Емельянова, В. В. Власов *, В.Е. Репин
Федеральное Государственное Учреждение Науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская область, Россия;
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия
Штаммы психрофильных эубактерий были выделены из проб льда из Антарктиды и идентифицированы на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Доминирующими видами в исследованных пробах льда из Антарктиды являются Arthrobacter spp., Janthinobacterium spp. и Pseudomonas spp. Кроме того, обнаружены эубактерии родов Flavobacterium, Polaromonas, Aquaspirillum, семейства Comamonadacea и др. (всего выделено 76 штаммов). Исследование активностей ферментов показало, что 6,9% от исследованных штаммов содержат эндонуклеазы рестрикции II-типа, 39% штаммов имеют плазмидные ДНК, отличающиеся по размерам. Следует отметить, что зависимости между наличием плазмид и устойчивостью к исследованным антибиотикам не обнаружено. Липазная активность, детектируемая с применением эфиров жирных кислот, обнаружена у 31,6% штаммов, щелочная фосфатаза – у 43%, неспецифические экзонуклеазы – у 16,4% штаммов.
Psychrophilic eubacterial strains have been isolated from ice samples from Antarctica and identified on the base of comparison of 16S rRNA gene structures. Arthrobacter spp., Janthinobacterium spp. и Pseudomonas spp. appeared to dominate among samples studied. Besides, eubacteria of genera Flavobacterium, Polaromonas, Aquaspirillum, family Comamonadacea and others have been found. Totally, 76 strains have been isolated. Study of enzymatic activity revealed, that 6.9% of strains contained restriction endonucleases of type II, 39% of strains were with plasmids of different lengths. One should note that correlation between the presence of plasmids and resistance to antibiotics studied were not discovered. Lypolitic activity detected by using ethers of fatty acids were found for 31.6% strains, alkaline phosphatase – for 43%, unspecific exonucleases – for 16.4% of strains.
Исследование биоразнообразия микроорганизмов в экстремальных условиях окружающей среды представляет теоретический и практический интерес. Микроорганизмы являются наиболее доступным и рентабельным источником ферментов. Ферменты, продуцируемые микробными клетками, такие как липазы, протеазы, эндонуклеазы рестрикции, экзонуклеазы, фосфатазы и др., находят широкое применение в биотехнологии. Задачи данной работы состояли в выделении штаммов эубактерий из проб Антарктического льда, идентификации бактерий на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, исследовании их фенотипических признаков, ферментативных активностей и содержания плазмидных ДНК.
Методы
Для выделение чистых культур микроорганизмов пробы или их разведения помещали на поверхность охлажденной агаризованной питательной среды и растирали стерильным охлажденным шпателем. Использованные питательные среды: агаризованная и жидкая среда LB, разбавленная (1:10) среда LB, крахмало-аммиачный агар (КАА), среда, состоящая из соответствующей пробы воды, стерилизованной фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,2 мкм, и 1,6% агара. Кроме того, психрофильные микроорганизмы выделяли, используя метод накопительных культур. Полученную культуральную жидкость рассевали истощением на агаризованную питательную среду для получения отдельных колоний. Инкубировали засеянные чашки при температуре 4-6º С в камере бытового холодильника. Просмотр посевов и подсчет численности выросших колоний проводили в течение 1-4 недель. Индивидуальные колонии, появившиеся на поверхности агаризованных сред и отличающиеся морфологическими признаками, переносили на свежие питательные среды и инкубировали в аналогичных условиях. Фенотипические признаки штаммов, ферментную активность и устойчивость к антибиотикам исследовали стандартными методами [1, 2]. Содержание эндонуклеаз рестрикции определяли методом скрининга отдельных колоний, взятых с плотной питательной среды. Наличие плазмидной ДНК определяли методом щелочного лизиса [3, 4].
Скрининг липолитической активности проводили на агаризованной среде LB, содержащей 1% эфиров жирных кислот, отличающихся количеством углеводородных атомов (твин-20, твин -40 или твин-80, соответственно, лауриловой, пальмитиновой и олеиновой кислот). Наличие липолитической активности штаммов определяли через 3-4 суток инкубирования при температуре 6°С по наличию зон помутнения агара вокруг колоний.
Для идентификации бактерий на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательности гена 16S рРНК, изолированные колонии полученных чистых культур инокулировали в жидкую среду LB, инкубировали до визуально обнаруживаемого роста при температуре 4°С. ДНК из чистых культур выделяли посредством лизиса осадка клеток в гуанидинизотиоцианате с последующей депротеинизацией смесью фенол-хлороформ pH 8,0 и осаждением изопропанолом. ПЦР проводили с универсальными праймерами F1 (прямой) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (позиции 1-20 на гене 16S рРНК Escherichia coli DQ360844) и R1 (обратный) 5`-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3` (позиции 1483-1502 на гене 16S рРНК Escherichia coli DQ360844); на амплификаторе “Терцик” (“ДНК-технология”, г. Москва) в следующем режиме: 94°С – 30 сек., 50°С – 30 сек., 72°С – 1 мин., 30 циклов. Для определения нуклеотидных последовательностей по Сэнгеру продукты ПЦР очищали гель-фильтрацией с использованием Sephadex G-100 (Pharmacia, Швеция) в микроколонке длиной 30 мм и диаметром 7 мм. Реакционная смесь объёмом 8,5 мкл содержала 200-600 фмолей очищенного продукта ПЦР, 1 пмоль соответствующего праймера и 3 мкл смеси BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Реакцию Сэнгера проводили с использованием амплификатора GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) в следующих условиях: 96°С - 20 сек; 96°С - 10 сек, 64°С - 4 мин, 2 цикла; 96°С - 10 сек, 60°С - 4 мин, 4 цикла; 96°С - 10 сек., 50°С - 7 сек, 64°С - 4 мин, 12 циклов; 96°С - 10 сек, 60°С - 4 мин., 4 цикла; 96°С - 10 сек, 50°С - 7 сек, 60°С - 4 мин, 12 циклов. Очистку от избытка флуоресцентномеченых дидезоксинуклеозид-5'-трифосфатов также осуществляли гель-фильтрацией с использованием SephadexTM G-50 Fine DNA grade (Amersham Biosciences, Швеция) в микроколонке длиной 30 мм и диаметром 7 мм. Анализ продуктов реакции Сэнгера проводили с использованием автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы MEGA версии 3.1 [5].
Результаты и обсуждение
Микроскопическое исследование проб воды из ледников Антарктиды после окрашивания клеток флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым позволило оценить плотность микроорганизмов около 106 клеток/мл. Титр жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) при высеве проб на использованные среды составлял значительно меньшие значения (3,2-9,2х103), при этом наибольшая численность микроорганизмов выявлена на среде минерального состава (КАА). Доминирующими видами в исследованных пробах льда из Антарктиды являются Arthrobacter spp., Janthinobacterium spp. и Pseudomonas spp. Кроме того, обнаружены эубактерии родов Flavobacterium, Polaromonas, Aquaspirillum, семейства Comamonadacea и др. (всего выделено 76 штаммов).
Изученные штаммы, за небольшим исключением, относятся к неферментирующим микроорганизмам, не имеют амилазы, небольшой процент из них обладает протеолитической активностью, у преобладающей части штаммов обнаружена оксидазная и каталазная активность. Показано, что 6,9% от исследованных штаммов содержат эндонуклеазы рестрикции II-типа – ферменты, широко распространенные среди микроорганизмов разных условий обитания, 39% штаммов имеют плазмидные ДНК, отличающиеся по размерам. Следует отметить, что строгого соответствия между наличием плазмид и устойчивостью к исследованным антибиотикам не обнаружено. Липазная активность, детектируемая с применением эфиров жирных кислот, обнаружена у 31,6% штаммов, щелочная фосфатаза – у 43%, неспецифические экзонуклеазы – у 16,4% штаммов.
Микробные липазы (КФ 3.1.1.3 - триацилглицеролгидролазы) представляют интерес с точки зрения изучения механизма действия ферментов на границе раздела фаз, реакций гидролиза, органического синтеза и переэтерификации биологически активных соединений. Липазы широко применяются на практике в различных производственных процессах, в составе синтетических моющих средств, высокоочищенные препараты фермента находят применение в медицине. Ферменты штаммов А-45р, А-50р А-52р, А-53р, А-55р, LV-6, LV-14, гидролизовали эфиры всех трех жирных кислот с различным молекулярным весом. По два субстрата утилизировали штаммы А-7р, А-23р, А-32р, А-33р, А-41 LV-17 (твин 20 и 40); штаммы LV9 и LV13 (твин 20 и 80) и штамм А-5p (твин 40 и 80). Только один субстрат гидролизуют штаммы А-1р, А-4р, А-46р, А-56р, А-57р и LV-5p (твин 80), а также A-12p и A-34p (твин 20). Штаммы, обладающие липазной активностью, представлены следующими видами: Aquaspirillum arcticum (A-12p), Pseudomonas aurantiaca (A-23p), Flavobacterium frigidarium (A-32p), Janthinobacterium lividum (LV6) и Polaromonas vacuolata (LV9). Полученные психрофильные продуценты ферментов могут представлять интерес для биотехнологического применения.
Литература
1. Методы общей бактериологии /под ред. Ф. Герхарда и др. М.:Мир, 1983. Т. 1. 536 с.; 1984. Т. 3. 263 с.
2. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 8th ed. V.1-2. / Ed. John G. Holt,- Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986. 1105 p.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М.: Мир, 1984. 399 с.
4. Marmur, J. and P. Doty. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. // J. Mol. Biol. 1962. V.5. P. 109-118."
5. Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinform. 2004. V. 5. № 2. P. 150-163.