Влияние пиримидинов Биджинелли на продукцию реактивных форм кислорода фагоцитирующими клетками крови в норме и патологии

Шубина Виктория С., Пущинский государственный университет, Пущино, Россия.

Проведен целенаправленный синтез пиримидинов Биджинелли (ПБ). Было показано, что исследуемые ПБ по разному влияют на продукцию реактивных форм кислорода (РФК) фагоцитирующих клеток, находящихся в различном функциональном состоянии. Следовательно, данные соединения могут быть использованы в создании тест-системы для мониторинга за процессом опухолевого роста и терапии.

Введение

Фагоцитирующие клетки (ФК) крови и генерируемые ими реактивные формы кислорода (РФК) играют существенную роль в защите организма при развитии опухолей, а регуляция продукции РФК фагоцитов является одной из наиболее актуальных задач при терапии различных патологических состояний, в том числе и онкологических. Поэтому поиск веществ, влияющих на продукцию РФК ФК перспективен на сегодняшний день. В последние десятилетие вырос интерес к синтезу пиримидинов Биджинелли (ПБ), который связан с различными биологическими эффектами, включая антивирусную, противоопухолевую, антибактериальную и противовоспалительную активности. Нами был целенаправленно синтезирован ряд соединений данного класса.

Целью данной работы являлось исследовать влияние синтезированных пиримидинов Биджинелли на продукцию реактивных форм кислорода фагоцитирующими клетками крови, находящимися в различных функциональных состояниях (в норме, при развитии асцитной гепатомы Зайделя и при терапии данного типа опухоли). Определить влияние ПБ на РФК-генерирующую активность фагоцитов в зависимости от уровня внутриклеточного кальция, так как было показано, что концентрация цитозольного Ca²⁺ и Ca²⁺ во внутриклеточных депо фагоцитов животных - опухоленосителей выше, чем у контрольных клеток в два раза. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

· Целенаправленно синтезировать пиримидины Биджинелли с необходимой нам структурой и определить их спектральные характеристики методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии.

· 2.Исследовать влияние ПБ на РФК-генерирующую активность фагоцитирующих клеток крови здорового животного. Определить влияние времени (продолжительности) инкубации клеток с ПБ на интенсивность хемилюминесцентного ответа (ХЛ-ответа).

· 3.Изучить влияние ПБ на продукцию РФК фагоцитов в ходе развития асцитной гепатомы Зайделя и при ее терапии.

· 4.Исследовать влияние ионов Ca²⁺ и совместного действия ионов Ca²⁺ и иономицина на ХЛ-ответ фагоцитов в ходе развития опухоли.

· 5.Изучить влияние уровня внутриклеточного кальция на продукцию реактивных форм кислорода фагоцитов при их стимуляции ПБ.

Продукцию РФК оценивали по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции. Измерения проводили при температуре 37° С и pH=7,6. В экспериментах использовали цельную кровь, а так же клетки, выделенные из крови крыс-самцов линии Вистар. В качестве стандартного активатора был использован ФМА (форбол 1,2-миристат-1,3-ацетат). Фагоцитирующие клетки крови выделяли из цельной крови по стандартному методу (Eggleton et al., 1989), модифицированному в нашей лаборатории (Поцелуева и др., 1995).

Действие веществ оценивали:

· по их способности увеличивать продукцию РФК фагоцитов при добавлении ПБ в максимуме ХЛ-ответа (стимулирующий эффект). Клетки предварительно стимулировались ФМА;

· по их способности увеличивать продукцию РФК фагоцитов в ответе на ФМА после предварительной инкубации клеток с ПБ (праймирующий эффект);

· по способности ПБ вызывать продукцию РФК фагоцитами без дополнительной стимуляции каким-либо веществом, подобным ФМА или ФМЛП (активирующий эффект).

Результаты и обсуждение

Нами были целенаправленно синтезированы 6 соединений данного класса: ДГП008, ДГП009, ДГП017, ДГП026, ДГП028, ДГП029. Было показано, что только последние два соединения не обладают флуоресценцией (табл. 1).

Табл. 1.Эмиссионные характеристики ПБ:

соединение	ДГП017	ДГП008	ДГП009	ДГП026	Скополетин
λ_возб	300 нм	270 нм	340 нм	340 нм	395 нм
λ_исп	310-385 нм	285-385 нм	370-470 нм	370-490 нм	440-500 нм
концентрация	8 мкМ	8 мкМ	8 мкМ	8 мкМ	8 мкМ

где λ_возб-длина волны возбуждения;

λ_исп-длина волны испускания.

Так же были определены абсорбционные характеристики веществ (табл. 2)

Табл. 2. Абсорбционные характеристики ПБ:

№	ДГП017	ДГП008	ДГП009	ДГП026	ДГП028	ДГП029
λ₁	275	285	280	275	315	280
ε₁	24000	27115	23560	21000	32400	27600
λ₂	305	315	300	300	-	300
ε₂	26000	27082	18400	12600	-	25700

Данные измерения проводились с концентрацией веществ в системе 10^{-5 М.}

Где λ_1,λ₂-длина волны поглощения;

ε_1,ε₂-рассчитанные коэффициенты экстинции при соответствующих длинах волн.

Было показано, что ПБ оказывают праймирующее и стимулирующее действия на продукцию РФК ФК здорового животного. Время инкубации клеток с ПБ не влияет на интенсивность ХЛ-ответа. Максимальный праймирующий и стимулирующий эффекты наблюдались при концентрациях веществ в системе 10^-5-0,5∙10^{-4 М.
Наиболее сильными стимулирующими (и, следовательно, праймирующими) агентами
оказались ДГП008 и ДГП009.}

При изучении влияния ПБ на продукцию РФК фагоцитирующими клетками крови, находящимися в различных функциональных состояниях (опухоленоситель, здоровое и терапевтируемое животные), было показано, что усиление ХЛ-ответа, на клеточных системах, содержащих ФК терапевтируемого животного, превышает усиление ХЛ в клеточной системе, содержащей ФК здоровой особи. При действии ПБ на клетки опухоленосителя стимулирующий эффект перестал наблюдаться на 2-4 сутки после трансплонтации опухоли. В целом, можно говорить о селективном действии исследуемых соединений на функционально различные пулы ФК. Исходя из предварительных экспериментов и литературных данных, можно предположить, что на стимуляцию продукции РФК пиримидинами влияет уровень внутриклеточного кальция.

Были проведены эксперименты с Ca²⁺-ионофорами, которые широко используются в экспериментальной практике для повышения концентрации Ca²⁺ в цитозоле. Было показано, что в присутствии иономицина и внешнего Ca²⁺ (2,5 мМ) ХЛ ответ ФК здорового животного, стимулированных ФМА, увеличивается примерно в 2-3 раза, однако при развитии опухоли этот эффект уменьшается и на 3-ие сутки исчезает. Это объясняется тем, что концентрация цитозольного Ca²⁺ и Ca²⁺ во внутриклеточных депо фагоцитов животных - опухоленосителей выше, чем у контрольных клеток.

Чтобы смоделировать влияние внутриклеточного кальция на праймирование фагоцитирующих клеток крови пиримидином ДГП008 были проведены следующие эксперименты: цельную кровь здорового животного инкубировали в течение 1 минуты с иономицином и внешним Ca²⁺ (2,5 мМ) после чего добавляли ФМА и в максимуме ХЛ-ответа добавляли исследуемое соединение. В контрольном эксперименте предварительной инкубацией с ионофором не проводилось. Интенсивность ХЛ в ответе на ФМА при дополнительной инкубации клеток с иономицином возрастает примерно в 2 раза, а время выхода ХЛ-ответа на максимум (или стационар) уменьшается примерно в1,5-2,0 раза, иначе говоря, иономицин праймирует фагоциты, в результате чего лаг-фаза уменьшается, а скорость ответа клеток на стимул ускоряется. При инкубации клеток с ДГП008 мы так же наблюдали увеличение интенсивности ХЛ в ответ на стимул (ФМА), аналогичные результаты получены и при добавлении веществ в максимуме ХЛ-ответа (предварительно активированные ФМА). Однако если клетки предварительно проинкубировать с иономицином, затем добавить стимул (ФМА) и в максимуме ХЛ-ответа внести вещество ДГП008, то наблюдается тушение ХЛ. Из этого следует, что присутствие иономицина и внешнего Ca²⁺ (2,5 мМ) снимает праймирующее действие ДГП008.

Кроме того, ПБ в концентрации 10^{-3 М способны
вызывать продукцию РФК ФК здоровых (5-10% от контроля) и терапевтируемых (до
40-50%) животных без дополнительной активации, тогда как на клетках
опухоленосителя, начиная с 3 дня, данный эффект не обнаруживается. По
предварительным результатам максимальным действием обладает соединение ДГП008.}

Выводы:

1. Определены спектральные характеристики ДГП008, ДГП009, ДГП017, ДГП026, ДГП028, ДГП029.

2. Исследуемые соединения в концентрации 10^-5-0,5∙10^-4М являются праймирующими и стимулирующими агентами по отношению к фагоцитирующим клеткам крови здоровых животных. Максимальный эффект наблюдается при действии соединений ДГП008 и ДГП009.

3. Стимулирующий эффект на клеточных системах, содержащих ФК терапевтируемого животного, превышает таковой в клеточных системах, содержащих ФК здоровой особи.

4. Подобно иономицину, стимулирующее действие ПБ перестает наблюдаться на 2-4 сутки после трансплантации асцитной гепатомы Зайделя.

5. Присутствие иономицина и внешнего Ca²⁺ (2,5 мМ) снимает праймирующее и стимулирующее действие ПБ.

6. ПБ в концентрации 10^{-3 М являются
активирующими агентами по отношению к ФК здоровых и терапевтируемых животных.}

7. Данные соединения, благодаря различному воздействию на продукцию РФК ФК здоровых, терапевтируемых животных и опухоленосителей могут быть использованы в создании тест-системы для мониторинга за процессом опухолевого роста и терапии опухоли.

Работа поддержана тематическим планом федерального агентства по образованию грантами CRDF №RUB2-010001-RU-05 и РФФИ