Детекция в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью основанных на FRET-эффекте полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций

Детекция в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью основанных на FRET-эффекте полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций

Чемерис А.В., Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Романенкова М.Л.,

Матниязов Р.Т., Князев А.В., Гималов Ф.Р., Вахитов В.А

Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа, Россия

Разработан вариант полимеразной цепной реакции в реальном времени на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), где сближенное расположение меченых праймеров обеспечивает флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET). При этом, помимо ряда других преимуществ, обеспечивается амплификация коротких фрагментов ДНК или РНК, которые с большей вероятностью могут сохраняться в старых или подвергнувшихся разрушительному воздействию образцах. Аналогичный способ с нарастающим гашением флуорохрома разработан для тех термоциклеров, где отсутствует возможность регистрации FRET. Разработан основанный на FRET-эффекте между красителями - донором и акцептором, входящими в состав соседних олигонуклеотидов, которые в ходе лигазной цепной реакции становятся единой молекулой, способ детекции ампликонов в реальном времени. Особенностями протекающей изотермически без участия ферментов гибридизационной цепной реакции является то, что в ней не происходит амплификации детектируемых фрагментов нуклеиновых кислот, а имеет место инициируемая полностью комплементарными искомыми последовательностями и свидетельствующая о присутствии таковых самосборка наноконструкций, несущих соответствующие флуорохромы, обеспечивающие FRET-эффект. Движущей силой ГЦР является временно скрытая энергия, заключенная в специальным образом сконструированных олигонуклеотидах.

Введение

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) широко используется как в фундаментальных исследованиях, так и для целей диагностики, тогда как ЛЦР в реальном времени (ЛЦР-РВ) пока остается невостребованной, хотя имеет перед ПЦР некоторые преимущества. Протекающая изотермически без участия ферментов гибридизационная цепная реакция (ГЦР-РВ) является, возможно, одним из основных методов ДНК/РНК диагностики будущего. ПЦР-РВ, ЛЦР-РВ и ГЦР-РВ проводили в ДНК амплификаторе iCycler iQ (Bio-Rad, США).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Поскольку размер ампликонов в ПЦР-РВ не должен быть большим, то здесь мы пошли дальше всех ранее предложенных вариантов и в нашем скоростном методе ПЦР-РВ, где стандартные 25 циклов завершаются менее чем за 15 минут, праймеры отжигаются встык, приводя к наработке целевого продукта размером всего около 40 пн. Такое расположение праймеров обеспечивает флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET), так как его эффективность обратно пропорциональна расстоянию между красителем-донором и красителем-акцептором в шестой степени и не может происходить при привычном расположении праймеров (рис. 1). При этом обеспечивается амплификация довольно коротких фрагментов или, точнее, обломков молекул ДНК или РНК, которые с большей вероятностью могут сохраняться в старых или подвергнувшихся сильному разрушительному воздействию образцах (например, при детекции ГМИ в продуктах питания или при анализе ДНК-следов с места преступления).

Рис. 1. Схемы расположения прямых (1 и 3) и обратного (2) праймеров (а) и протекания ПЦР-РВ с FRET-эффектом между донорным (D) и акцепторным (A) красителями (б). Волнистой стрелкой показан перенос энергии от красителя F (FAM) к красителю R (ROX), а радиальные лучи символизируют свечение.

При этом до минимума сокращается время, требуемое для построения комплементарных цепей, и этап элонгации становится не нужным. Благодаря тому, что целевой продукт ПЦР имеет небольшой размер, существенно снижается температура денатурации, при которой цепи ампликона должны разойтись и стать новыми матрицами для отжига праймеров. С одной стороны, это экономия времени вообще, так как переходы от одной температуры к другой не мгновенны, а с другой - сокращение времени пребывания ДНК полимеразы при высоких температурах, что продлевает срок жизни фермента, обеспечивая в целом более надежную амплификацию. Расположение праймеров встык гарантирует высокую специфичность предложенного варианта ПЦР-РВ, поскольку случаи фальш-праймирования, вызванные отжигом на других местах расположенных вплотную сразу двух праймеров, "связанных" между собой FRET-эффектом, практически невозможны.

Из приведенной схемы протекания варианта ПЦР-РВ с FRET-эффектом, названного нами "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) видно, что в качестве положительно-отрицательного контроля была проведена амплификация с третьим удаленным праймером, обеспечившим по данным гель-электрофореза (не показано) наработку продукта, но не перенос энергии, что также подтверждает высокую специфичность ПЦР-РВ "УФА".

Аналогичный способ ПЦР-РВ с нарастающим гашением флуорохрома (рис. 2) разработан для тех ДНК амплификаторов, где отсутствует возможность регистрации FRET.

Рис. 2. Схема протекания ПЦР-РВ с гашением флуоресценции красителя F (FAM) универсальным гасителем Q (Dabcyl). Радиальные прямые лучи символизируют свечение, а радиальные извитые - выделение тепла.

Изучение транскрипционной активности генов представляет собой важную задачу, часто решаемую с помощью ПЦР-РВ. Использование для этой цели ПЦР‑РВ "УФА" в случае генов, содержащих интроны, позволяет обходиться без ДНКазной обработки и уверенно детектировать количество транскрибируемой РНК, полностью исключая вклад самого гена (рис. 3).

Рис. 3. Схема расположения прямого (F) и обратного (R) праймеров в ПЦР-РВ "УФА" с FRET-эффектом между донорным (F - FAM) и акцепторным (R - ROX) красителями для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны.

Определение произошедшего трансгеноза при анализе трансгенных растений с помощью ПЦР из-за сверхвысокой чувствительности этой реакции и надолго остающихся агробактерий часто не представляется возможным. Однако расположение прямого и обратного праймеров на границах искусственных экзонов и интрона в маркерном гене uid (gus), содержащемся в бинарном векторе pCambia-1305.1, позволило нам с помощью ПЦР-РВ "УФА" не только доказать произошедшую трансформацию, но и оценить уровень транскрипции маркерного трансгена.

Лигазная цепная реакция в реальном времени

Нами разработан способ детекции ампликонов в ЛЦР-РВ, основанный на FRET-эффекте между присоединенным к одному олигонуклеотиду красителем-акцептором и возбуждаемым красителем-донором, входящим в состав соседнего олигонуклеотида, которые в ходе ЛЦР в результате лигирования становятся единой молекулой (рис. 4). Важными чертами ЛЦР является возможность детекции коротких фрагментов ДНК или РНК, причем последние без этапа обратной транскрипции могут служить матрицами для лигирования олигонуклеотидов.

Рис. 4. Упрощенная схема протекания ЛЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным (D) и акцепторным (A) красителями, присоединенными к соседним олигонуклеотидам. Точкой показано произошедшее лигирование. Волнистой стрелкой показан перенос энергии, а радиальные лучи символизируют свечение.

Гибридизационная цепная реакция в реальном времени

Особенностями ГЦР является то, что в ней не происходит амплификации детектируемых фрагментов ДНК или РНК, а имеет место изотермическая (в широком диапазоне температур) самосборка наноконструкций, инициируемая искомыми последовательностями и свидетельствующая о присутствии таковых. Движущей силой ГЦР является временно скрытая энергия, заключенная в специальным образом сконструированных олигонуклеотидных наноструктурах, представляющих собой шпильки с верхушечной петлей, двуцепочечным стержнем и одноцепочечным участком. Стержневые части данных олигонуклеотидов полностью комплементарны друг другу и с учетом антипараллельности цепей ДНК одинаковы у обеих структур, а одноцепочечные участки расположены: один на 5'-конце одного, а другой на 3'-конце другого этих сложных олигонуклеотидов. При этом петля первой шпилечной структуры полностью комплементарна выступающему одноцепочечному участку на 5'-конце второго олигонуклеотида, а петля второй шпилечной структуры - комплементарна такому же участку, только расположенному на 3'-конце первой. В отсутствие инициаторной молекулы эти олигонуклеотидные конструкции стабильны и не вступают в реакцию гибридизации. Однако стоит только появиться в реакционной смеси искомой (инициаторной) последовательности ДНК или РНК, как шпильки начинают поочередно раскрываться, и происходит пошаговое удлинение цепей ДНК, детекция чего велась нами по увеличивающейся, благодаря FRET-эффекту, флуоресценции красителя-акцептора (рис. 5), при этом рост свечения характеризовался стандартной кривой, быстро выходящей на плато. Причем инициация ГЦР происходила лишь в том случае, когда между инициаторной молекулой и первой шпилькой на отрезке стержня и выступающего участка была полная гомология.

Рис. 5. Схема протекания ГЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным (D) и акцепторным (A) красителями, присоединенным к разным олигонуклеотидным шпилькам. Волнистой стрелкой показан перенос энергии, а радиальные лучи символизируют свечение.

Несмотря на то, что ГЦР-РВ с FRET-эффектом пока уступает по чувствительности и ЛЦР-РВ и ПЦР-РВ, нам представляется, что у этой реакции, тем не менее, есть хорошие перспективы.

Благодарности

Данная работа выполнена в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ - НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4 и Государственного контракта ФЦНТП № 02.445.11.7018.