Белковая кристаллография как идеальный инструмент для исследования механизма работы ферментов
A. Никулин, M. Гарбер, С. Никонов
Институт белка РАН, Пущино, Московская обл., Россия
С. Ревтович, E. Морозова, T. Демидкина
Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва, Россия.
Рентгеновская или белковая кристаллография является совершенным и широко распространенным в мире методом исследования структур биологических макромолекул и механизма работы активных центров ферментов на атомарном уровне. Во всем мире данный метод активно используется для разработки и конструирования новых лекарств.
Институт белка РАН и Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН – одни из ведущих российских институтов в области молекулярной биологии. Институты имеют современное оборудование, программное обеспечение и опытных сотрудников для проведения кристаллографических исследований макромолекулярных объектов любой сложности. Определение трехмерной структуры фермента L-метионин γ-лиазы является хорошим примером плодотворной совместной работы в данной области.
За последние 50 лет белковая кристаллография прошла путь от очень трудоемкого и сложного метода до широко используемой и достаточно простой методики определения и анализа пространственных структур макромолекул. Успехи в развитии, как инструментальной части, так и программного обеспечения позволили ученым изучать тончайшие структурные детали таких сложных биологических процессов как биосинтез белков и фотосинтез. Определение структур макромолекул имеет не только фундаментальное значение, но и большое прикладное применение. Рентгеновская кристаллография широко используется для дизайна и направленной модификации молекул с целью дальнейшего их использования в медицине и промышленности. По своей сути рентгеновская кристаллография является старейшим методом нанотехнологии.
Важность белковой кристаллографии привело к взрывному росту числа кристаллографических лабораторий во всем мире. В России, к сожалению, их практически не осталось. Институт белка РАН является в этом смысле уникальным исследовательским центром, который располагает как современным экспериментальным оборудованием для белковой кристаллографии, так и квалифицированными научными кадрами. Институт имеет современный рентгеновский детектор MAR Research Image Plate IP345 в комплексе с установкой замораживания кристаллов в струе жидкого азота Oxford Instruments. В этом году нам будет поставлен микрофокусный рентгеновский генератор Micro Star BRUKER-AXS с высокой интенсивностью пучка. Лаборатория оснащена современным биохимическим оборудованием для получения, очистки и кристаллизации как белков, так нуклеиновых кислот. Для определения пространственных структур макромолекул и их анализа имеется ряд рабочих станций с поддержкой стерео графики. Результатом работы является внушительный список из структур более 15 негомологичных белков и 7 РНК-белковых комплексов, определенных сотрудниками института за 10 последних лет.
Наш институт плодотворно сотрудничает с Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Структурные исследования фермента L-метионин γ-лиазы является очень показательным примером плодотворной совместной работы в области структурной молекулярной биологии.
L-метионин γ-лиаза (МГЛ, EC 4.4.1.11) – это пиродоксаль 5'-фосфат (ПЛП) зависимый фермент, который катализирует γ-элиминирование и γ-замещение L-метионина и его производных. Кроме того, фермент способен катализировать β-элиминирование и β-замещение L-цистеина и S-замещенного L-цистеина [1,2]. К данному ферменту проявляется большой интерес, поскольку имеются данные зависимости от метионина раковых и опухолевых клеток. Было обнаружено, что фермент может быть эффективным противоопухолевым агентом in vitro и in vivo [3] и является потенциальным агентом при атеросклерозе, тучности, болезни Паркинсона. Фермент МГЛ, по всей видимости, участвует во многих процессах метаболизма серосодержащих аминокислот в бактериях, однако МГЛ не был обнаружен в клетках млекопитающих [3]. Таким образом, ингибиторы этого фермента должны быть эффективными средствами химиотерапии против многих патогенных микроорганизмов, особенно трихомонад и энтаамеб.
В 2004 мы определили пространственную структуру фермента МГЛ из организма Citrobacter freundii с разрешением 2.0Å [4]. МГЛ как в растворе, так и в кристалле образует гомотетрамеры. Каждая субъединица состоит из трех отдельных доменов, называемых N-концевым доменом, пиродоксаль-связывающим доменом и C-концевым доменом. Две субъединицы образуют каталитический димер, в котором два активных центра образованы аминокислотными остатками принадлежащих обеим субъединицам. Два таких каталитических димера образуют тетрамерную молекулу фермента. ПЛП ковалентно присоединен к концевому азоту лизина 210, входящего в состав ПЛП-связывающего домена.
В 2005 мы улучшили разрешение пространственной структуры фермента до 1.35Å, а также получили кристаллы ряда комплексов МГЛ с различными молекулами субстратов и ингибиторов. Структуры комплексов были определены нами с разрешением от 1.45Å до 1.80Å. Большое количество структурных данных высокого разрешения позволило нам исследовать механизм работы фермента с очень высокой точностью. Полученные результаты являются весьма ценными с точки зрения исследования механизма работы фермента, более того, они могут послужить прекрасной начальной точкой для конструирования очень специфичных ингибиторов L-метионин γ-лиазы.
Работа поддержана Российской академией наук, Российским фондом фундаментальных исследований (№05-04-48010), Советом при Президенте РФ и программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН. Работа М. Б. Гарбер поддержана грантом Медицинского Института Говарда Хьюза (#55005609). Работа Т. В. Демидкиной поддержана Международным фондом Фогарти (# 1 R03 TW006045-01A2).
[1] H. Tanaka, N. Esaki & K. Soda, Biochemistry 16, 100-106 (1977).
[2] H. Tanaka, N. Esaki & K. Soda, Enzyme Microb. Technol. 7, 530-537 (1985).
[3] R.M. Hoffman, Human Cell 10, 69-80 (1997).
[4] D.V. Mamaeva, E.A. Morozova, A.D. Nikulin, S.V. Revtovich, S.V. Nikonov, M.B. Garber and T.V. Demidkina, Acta Crystallographica F61, 546-549 (2005).