Нестеренко В.Ф. Институт биомедицинских технологий ВТУ Москва
Андреева Ж.И. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Мы сконструировали прибор, позволяющий быстро выбрать аффинный сорбент для очистки исследуемого препарата. Благодаря такому прибору выбрали из 38-и сорбентов с различными красителями один, наиболее подходящий, который в качестве лиганда имел золотисто-желтый краситель, позволивший очистить Гемолизин II из B.cereus впервые за 30 лет до гомогенного состояния с большим выходом (9). На Международной специализированной выставке “Мир биотехнологии 2006” Московской международной конференции 14 – 17 марта 2006 «Биотехнология и медицина» этот прибор был награжден дипломом и золотой медалью.
Введение
Аффинные сорбенты с красителями в качестве лигандов нашли широкое применение в различных областях биохимии, молекулярной биологии и медицине.(1,2). Особенно широкое применение нашли «проционовые» или триазиновые красители для аффинной хроматографии белков. Это легко понять, так как они используются для окраски тканей в текстильной промышленности и их отбор, соответственно, велся по высокому сродству к белкам шерсти, льна, шелка др. [3, 4]
Иммобилизованные красители используют для очистки почти гомогенных белков. Например, очистку интерферона для терапевтических целей удается осуществить только на красителях. Здесь не может конкурировать даже хроматография на иммунносорбентах. Колонки с активными красителями используют при очистке IgG от альбумина, а также для разделения изоферментов, функционально активных ферментов от неактивных и, наконец, мутантных — от «диких» и т.д. [5].
„Сibасгоn В1u" выступает в качестве аналога НАД [6], но с ним могут, связываться и СоА-зависимые ферменты, гидролазы, РНК- и ДНК-специфичные ферменты, комплемент и интерферон [7], а “Ргосion Red НЕ 3В” имеет большее сродство к НАДФ+ - зависимым дегидрогеназам и киназам.
Два желтых красителя (III и IV), хотя и очень похожи по структуре, имеют большое различие в степени сродства к ферментам [8]
Емкость сорбентов с красителями может быть в 10—100 раз выше, чем у аффинных сорбентов с иммобилизованными нуклеотидами или другими лигандами.
Результаты
Прибор состоит из 20-и мини колонок(11 х 50мм) с аффинными сорбентами, содержащих в качестве лигандов различные красители. Колонки находятся в общей камере. Одна из колонок, в качестве контроля неспецифической сорбции, содержит матрикс Biogel A 1.5m фирмы
“Bio-Rad” без красителя. Прибор позволяет проводить хроматографию одновременно на всех колонках.
Fig.1 (А). Demonstrated chemical structure of ligand choice sorbent for purification of Hemolysine II B..cereus1
(B) Purification of HlyII from the bacterial culture supernatants. SDS–polyacrylamide gel (12%) of samples from each purification step.
Table 1 demonstrated output of purity Hemolysin II over 50% .
Fig. 1.
(A) The chemical structure of Procion yellow MX-R. Puri.cation of HlyII.
(B) Puri.cation of HlyII from the bacterial culture supernatants. SDS–polyacrylamide (12%) gel of samples from each puri.cation step. Lane 1, molecular weight markers; lane 2, the culture concentrate; lane 3, a fraction pool from the phosphocellulose P11 column; lane 4, a fraction pool from the pseudo-a.nity column; lane 5, puri.ed HlyII protein after gel-.ltration on Superose 12.
(C) Puri.cation of HlyII from cells extracts. SDS–polyacrylamide (12%) gel of samples from each puri.cation step. Lane 1, clari.ed lysate; lane 2, a fraction pool from CM cellulose column; lane 3, gel-.ltration on AcA44; lane 4, gel-.ltration on Superose 12; lane 5, the puri.ed HlyII protein (a marker). Twenty microliters from samples from each fraction was boiled with one equivalent of 2· SDS sample bu.er, and 10 ll was loaded onto the gel. HlyII migrates lower than the 45 kDa marker.
(D) The expression of His-tagged HlyII, BL21(pET29-HlyII-His). Coomassie-stained
SDS–polyacrylamide (12%) gel of bacterial cell lysates before IPTG induction and 1, 2, and 3 h after induction. The induced HlyII migrates lower than the 45 kDa markers, lane 1. Cell pellets from 1 ml of medium before and after induction were boiled with SDS sample bu.er and loaded on the gel.
Table 1
Коммерческие фирмы выпускают сорбенты с теми красителями, которые дали положительные результаты в исследовательских лабораториях. Исследовательские же лаборатории придерживаются своих методов, используя дорогостоящие технологии.
Только в тех лабораториях, где отсутствует дорогостоящее оборудование и сорбенты, был прямой смысл изобрести такой дешевый, эффективный прибор и предложить его всем исследовательским и технологическим лабораториям и фирмам! Ориентировочная стоимость такого прибора с 20-ю колонками 600 у.е., в то время как одна колонка 5мл с голубой агарозой стоит около 60 у.е.
Следуя указаниям протокола, прилагаемого к прибору, можно подобрать подходящий сорбент всего за один день и заказать его в необходимом количестве. Планируется выпускать две серии приборов А и В. Сорбенты обозначены порядковыми номерами от 1а до 19а и от 1в до 19в.
Please address applications with letter of intent to:
117292 Moscow, Kedrova str. 8, building 2, room 503
Institute of Biomedical Technologies WTU
Director, D.Sc. (Medicine), Professor
Belyaev Mikhail Victorovich
REFERENCES
1. Buneman H., Muller W. //Nucl. Acid. Res.— 1978,- V. 5.-P. 1059.
2. Buneman H., Muller W. //Affinity Chromatografy. Hoffman-Ostenhof 0. et al. ,eds. Pergamon Press. N. Y., 1978.
3. Ivanov V.B. // Active dyes in biology ., Nauka Eds, 1982.
4. Scopes R. K. Die-Ligands and multifunctional Absorbents: An Empirical Approach to Affiniti Chromatografy //Anal. Biochem. 1987.- V. 165.— P. 235—246 [Rev].
5. Osterman L.A.// Chromatography of proteins and nucleic acids. Moscow, Nauka Eds. 1985
6. Thompson S. T., Steliwaqen F. //Proc. Nat. Acad.-1975- V.72.-P. 669-672.
7. Low C. R., Small D. A. P., Alkinson A. /'//Inter. J. Biochem.- 1981- v. 13.-P. 33-40.
8. 8 Low C. R. et all //Anai. Biochem.—1980—V. 104.-P. 23-28. 1,8 t. zn.
Andreeva J.I., Nesterenko V.F. et.all. //Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II // Protein Expression and Purification- 2006, 47,186 -193