Генная терапия РС на модели ЭАЭ у крыс
Т.Заргарова, О.Кулакова*, В.Прасолов*, Т.Жармухамедова, В.Туробов, О.Дерюгина, М.Судомоина*, Ю.Чернаевский†, О.Фаворова*
Филиал Института Биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, РАН, Пущино, Россия, * Российский Медицинский Университет, Москва, Россия, † Bone and Joint Research Unit, Barts and The London, Queen Mary’s School of Medicine and Dentistry, University of London, UK
Введение
Рассеянный склероз (РС) – хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, представляющее серьезную медицинскую и социальную проблему. Этиология РС остается неясной, а одна из наиболее обоснованных теорий его патогенеза предполагает, что основную роль в разрушении миелина играет воспалительный процесс, связанный с аутоиммунными реакциями. Важную роль в изучении этиологии РС играет модельная патология, схожая с РС по клиническим и гистологическим признакам. Такой моделью служит экспериментальный аутоиммунный (или аллергический) энцефаломиелит (ЭАЭ) - индуцируемое антигенами миелина и опосредованное Т-клетками аутоиммунное заболевание животных.
При выяснении природы факторов, определяющих восприимчивость организма к РС и ЭАЭ, все большее внимание исследователей привлекают цитокины – пептидные медиаторы иммунного ответа. Это связано с тем, что лимфоциты и макрофаги, основные участники воспалительного процесса в ответ на активацию антигеном продуцируют определенный набор цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF)-α, лимфотоксин (TNF-β) и интерферон (IFN)-γ, продуцируемые CD+4 Th1 клетками (1,2). Однако известно, что противовоспалительный цитокин TGF-β1 снижает выработку указанных воспалительных цитокинов и, введенный экзогенно в более позднюю фазу острого ЭАЭ или во время повторного заболевания, предотвращает развитие болезни и ослабляет ее клинические признаки (3).
Системное введение активного TGF-β1 ограничивается коротким периодом его жизни в биологических жидкостях организма, а также сопровождается нежелательными побочными эффектами. Поэтому в своей работе мы исследовали влияние на течение ЭАЭ крыс латентного цитокина, продуцируемого сингенными фибробластами, трансдуцированными геном-предшественником TGF-β1 (pTGF-β1).
В экспериментах были использованы крысы линии DA, у которых можно индуцировать ремиттирующую форму заболевания с обширной демиелинизацией, что наиболее адекватно моделирует РС.
Первичные фибробласты, трансдуцированные preTGF- β1, облегчают течение ЭАЭ у крыс
ЭАЭ у крыс линии DA (220-250 г) индуцировали путем введения в подушечки задних лап по 100 мкл гомогената сингенной хорды в полном адъюванте Фрейнда (1:1 w/v). На третий день после иммунизации экспериментальным животным (12 крыс) вводили первичные фибробласты, трансдуцированные геном pTGF-β1 (3х106 клеток, внутрибрюшинно). Контрольная группа (10 животных) подвергалась иммунизации таким же количеством нетрансдуцированных фибробластов.
Фибробласты – одна из клеточных популяций, которая может быть использована для генетических модификаций с последующей имплантацией в организм. Иммунный ответ на экзогенно введенные клетки, изначально полученные из организма хозяина или сингенного животного, минимален и не приводит к их отторжению. Для эффективного переноса гена pTGF-β1 в первичные фибробласты кожи крыс линии DA был использован ретровирусный вектор pTGF-β1-pBabe-neo(-5’UTR).
Всех иммунизированных животных ежедневно в течение 23 дней взвешивали и регистрировали клинические признаки, используя следующую шкалу степени тяжести ЭАЭ:
0 – отсутствие симптомов;
1 – понижение тонуса хвоста;
2 - ослабление мышц задних конечностей, нарушение походки;
3- паралич задних конечностей;
4 – полный паралич конечностей;
5 – смерть животного.
Эксперименты in vitro показали, что первичные фибробласты, трансдуцированные геном pTGF-β1 продуцируют и выделяют pTGF-β1. При этом биологическую активность TGF-β1, после активации латентного цитокина, оценивали по его антипролиферативному действию на клеточную линию Mv1Lu. Результаты этих тестов представлены на рис.1
Рис.1 Ингибирующее влияние TGF-β1, содержащегося в среде культивирования фибробластов, трансдуцированных pTGF- β1, на рост клеток Mv1Lu, определенное с помощью МТТ- теста.
Кривая 1 и 2 – неактивированная среда культивирования контрольных и трансдуцированных pTGF-β1 клеток, соответственно; кривая 3 и 4 - активированная нагреванием (800C, 10 мин) среда культивирования контрольных и трансдуцированных pTGF- β1 клеток, соответственно. Log2N – логарифм двукратных последовательных разведений среды культивирования.
Каждая точка – усредненное значение по трем измерениям ± SEM
Методом иммуноферментного анализа с использованием активного TGF- β1 (Genzyme, США) в качестве стандарта, было показано, что клетки, трансдуцированные pTGF-β1, продуцировали 2.4 ng/ml TGF-β1 (в расчете на 106 клеток) в течение 24 часов, что в 3.3 раза больше, чем контрольные клетки.
Первичные фибробласты, трансдуцированные геном pTGF-β1, введенные крысам на ранней стадии заболевания (на третий день после иммунизации) достоверно снижали показатели заболеваемости и степени тяжести ЭАЭ по сравнению с контрольными животными (рис 2).
Рис.2 Снижение степени тяжести ЭАЭ у крыс линии DA после введения им первичных фибробластов, трансдуцированных геном pTGF- β1.
Кривая 1 – группа животных (n=12), которым через 3 дня после иммунизации гомогенатом сингенной хорды в полном адьюванте Фрейнда ввели внутрибрюшинно 3х106 первичных фибробластов, трансдуцированных геном pTGF- β1. Кривая 2 – контрольная группа крыс (n=10), которым ввели такое же количество нетрансдуцированных первичных фибробластов.
Так, у животных, которым были введены модифицированные фибробласты, максимальная степень тяжести ЭАЭ составляла 2.0, и общее состояние крыс практически возвращалось к норме к 23-му дню наблюдения, в то время как у контрольных крыс состояние полного развития болезни (3,5 -4 балла), было стабильным и длилось до конца эксперимента.
Таким образом, в наших опытах было показано, что первичные фибробласты крыс линии DA, генетически модифицированные с целью экспрессии латентного TGF- β1, синтезируют и выделяют этот цитокин в латентной форме. Термическая обработка предшественника переводит его в активную форму, которая оказывает антипролиферативное воздействие на Mv1Lu клетки in vitro. В организме же крысы его неактивная форма активируется в очагах воспаления в количествах, достаточных для торможения воспалительного процесса в центральной нервной системе, что приводит к снижению степени тяжести ЭАЭ у экспериментальных животных.
Литература
1. Powel MB, Mitchell D, Lederman J et al. Lymphotoxin and tumor necrosic factor-alpha production by myelin basic protein-specific T cell clones correlates with encephalitogenicity. Int Immunol 1990; 2:539-44.
2. Sedgwick JD, MacPhee IA, Puklavec M. Isolation of encephalitogenic CD4+ T cell clones in the rat.
Cloning methodology and interferon-gamma secretion. J Immunol Meth 1989; 143:3492-7.
3. Kuruvilla AP, Shah R, Hochwald GM, Liggitt HD, Palladino MA, Thorbecke GJ. Protective effect of transforming growth factor beta 1 on experimental autoimmune diseases in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:2918-21.