Изучение влияния ампициллина на микробиоту кишечника у крыс методом газовой хроматографии – масс спектрометрии по маркерным веществам в крови

 

Дьяченко И.А², Осипов Г.А¹., Архипова А¹, Захарова Л², Мурашев А.Н.²

 

Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева.¹

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.²

 

Well-known the judgments about decrease of population normal mycrobiots intestines under action of antibiotics also are standard. However it cannot be counted correct and proved as actually as the basis for such conclusion analyses of excrements have served, instead of at стеночной mycrobiots.  The quantitative method of the analysis of its structure is necessary for the control and management mycrobioting intestines, and it is recently received as опосредованного definitions of its structure according to weight - spectrometry of fat acids. Results of research have shown protective action лактулозы at introductions with an antibiotic ампициллина 500ml/kg and lactuloses 70 ml/kg, for 14 and 21 day of introduction.

 

Общеизвестно и общепринято суждение о снижении популяции нормальной микробиоты кишечника под действием антибиотиков. Однако это нельзя считать корректным и доказанным, так как на самом деле основанием для такого вывода послужили анализы фекалий, а не пристеночной микробиоты. Материал фекалий является отходом собственно микробного обмена веществ на кишечной стенке. В фекалиях продолжается продукция микроорганизмов, но уже в иных условиях по сравнению с верхними отделами кишечника. Для  контроля и управления микробиотой кишечника необходим количественный метод анализа ее состава, и он недавно получен в виде опосредованного определения ее состава по данным масс-спектрометрии жирных кислот. При использовании этого метода накоплена информация по пристеночной микрофлоре тощей, подвздошной и ободочной кишок путем ГХ-МС анализа микробных маркеров в  биоптатах, получаемых в отделении патологии тонкого кишечника ЦНИИГ, возглавляемом зам директора института профессором Парфеновым А.И., при исследованиях здоровых добровольцев и больных с синдромом раздраженного кишечника (СРК) и антибиотико-ассоциированной диареей (ААД). Эти исследования впервые позволили установить характер распределения микроорганизмов по отделам кишечника. Их сопоставление с анализом фекалий у тех же пациентов показали, что адекватно динамике заболевания и лечения пробиотиками меняется только пристеночная микробиота. Основной тенденцией ААД является уменьшение численности большинства микроорганизмов, - 22 из 50 контролируемых более чем в 50% случаев и в сумме вплоть до семикратного снижения уровня колонизации кишечной стенки. В то же время было отмечено существенное (более чем в два раза) увеличение численности  13 из 50 контролируемых микроорганизмов. Однако отнесение экспериментально обнаруженного дисбактериоза только к влиянию антибиотиков было бы не корректным, поскольку очень похожие дисбиотические нарушения найдены и при СРК. Обе группы пациентов имели сочетанные патологии, им назначали антибиотики с целью лечения интеркуррентных инфекций. Поэтому, для получения достоверного изучения  изменений кишечной микробиоты необходимы опыты на близких по физиологическому статусу животных.

В цитированной выше работе при параллельном анализе крови тех же пациентов установлены адекватные кишечным биоптатам изменения состава микробных маркеров. С тех пор метод постоянно используется в качестве неинвазивного способа оценки изменений пристеночной, функциональной, микробиоты  кишечника в норме и патологии. Он применен нами в настоящем исследовании для определения изменений кишечной микробиоты крыс при воздействии больших доз ампициллина, а также попытки компенсации индуцированных антибиотиком ее изменений при одновременном введении лактулозы. Ампициллин вводили зондом в желудок животных в дозе 500 мг/кг три раза в сутки в течение трех недель. Часть животных получала ампицилин вместе с лактулозой в дозе 70 мл/кг. На 14 и 21 день у животных забирали кровь для определения концентрации микробных маркеров в крови методом газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией.

Проведено две серии исследований, в одной из них (табл. 1) отмечено достоверное снижение лактобацилл у животных при введении только ампициллина до  2729±204 кл/гх10⁵ и 2760±633 кл/гх10⁵  на 14 и 21 день соответственно относительно 3653±217 кл/гх10⁵  у интактных животных. Изначальное введении композиции ампициллин – лактулоза (70 мл/кг) способствовало достоверному увеличению численности лактобацилл относительно контрольных животных как на 14 день (4348±233 кл/гх10⁵ ) так и на 21 день (4046±345 кл/гх10⁵). Численность бифидобактерий в процессе эксперимента не изменялась.

 

Таблица 1

Изменение численности  лактобацилл и бифидобактерий  при действии антибиотика ампициллина, а также при одновременном введении лактулозы.

 

* - Р<0.05 по критерию Стьюдента относительно контрольных животных.

# - <0.05 по критерию Стьюдента относительно животных получавших Ампициллин.

 

Концентрация маркеров остальных микроорганизмы доминантной группы кишечника – родов Eubacterium (Рис 1), Clostridium, Ruminococcus, Enterococcus, Streptococcus, сем Enterobacteriaceae, а также актинобактерий, бактероидов, микроскопические грибов и других – всего 55 таксономических единиц – не претерпели существенных изменений в пределах биологической воспроизводимости анализа, которая составляет 20% относительно измеряемой величины. Это означает, что ампициллин не привел к снижению численности микробиоты кишечника, в том числе по сумме микроорганизмов (рис 2).

 

 

 

Рис. 1. Изменение концентрации основной группы эубактерий (род Eubacterium) в кишечнике крыс под действием ампициллина и при совмещенном введении в желудок с лактулозой

 

Рис. 2. Изменение общей микробной колонизации кишечной стенки крыс под действием ампициллина и при совмещенном введении в желудок с лактулозой

 

Это означает, что кишечная микробиота крыс чрезвычайно устойчива к действию этого антибиотика. Соответственно и эффект лактулозы остался не выявленным в достаточной мере. Введение ампициллина имело свои клинические проявления (табл. 2), но не через посредство индуцированного дисбактериоза, а по иному механизму интоксикации организма животного.  Мониторинг лечения воспалительных процессов у людей при использовании масс-спектрометрии дает основание полагать, что микробиота человека тоже не просто поддается действию антибиотиков. Их применение в пределах доз и времени, рекомендуемых в аннотации, не приводит к изменению количества основных функциональных групп микроорганизмов. При обследовании и лечении угревой болезни было найдено, что метронидазол, напротив,  стимулирует их рост. Приведенные здесь данные в опыте на животных, вне зависимости от сопутствующей терапии и сочетанных патологий, дает серьезный повод для дальнейших количественных исследований влияния антибиотиков на гомеостатическую микробиоту пристеночного слоя кишечника, реально отвечающую за обмен веществ макроорганизма.

 

Таблица 2

 Клинический осмотр животных.

Группа	Признаки %
	Аллопеция разной локализации			Ослабленный (мышечный) тонус и вялость			Мягкие, масленичные фекалии
	7 день осмотра	14 день осмотра	21 день осмотра	7 день осмотра	14 день осмотра	21 день осмотра	7 день осмотра	14 день осмотра	21 день осмотра
Растворитель (n= 24)	–	–	–	–	–	–	–	–	–
Ампициллин 500 мг/кг 14 день (n= 24)	50	58,33	63,5	66,67	91,67	100	66,67	100	100
Ампициллин 500 мг/кг + Лактусан 70 мг/кг (n= 36)	12,5	–	–	18,75	6,25	6,25	18,75	12,5	18,3