Дебабов В.Г., ФГУП ГосНИИгенетика, Москва, Россия
Паучий шелк состоит из белков (спидроинов) и является уникальным материалом, сочетающим в себе необыкновенную прочность и эластичность. Кроме того, этот материал не токсичен, биосовместим и обладает способностью к биорезорбции, что открывает широкие возможности для его использования в медицине. Паучий шелк нельзя получить из пауков в ощутимых количествах, достаточных для практического применения. В последние 10 лет в мире, в том числе и в ГосНИИгенетике ведутся работы по получению рекомбинантных белков – аналогов спидроинов. Нам удалось получить достаточно высокую экспрессию аналога спидроина - каркасной нити паука Nephila clavipes в дрожжах Pichia pastoris. Рекомбинантный белок очищен до гомогенного состояния и из него получены нити, превышающие по прочности сухожилия и кости. Показана принципиальная возможность экспрессии этого белка в растениях. В настоящее время ведется работа с аналогом спидроина 2. Мы хотели бы найти партнеров для биологических испытаний наших материалов, для исследования молекулярного строения нитей.
Работы в ГосНИИгенетике были сосредоточены на белках (спидроинах), входящих в состав каркасной нити – наиболее прочной нити паутины. Каркасная нить состоит их двух белков спидроина 1 и спидроина 2, которые входят в состав паутины в соотношении 2:1. К началу нашей работы были расшифрованы последовательности генов только паука Nephila clavipes. Спидроины наверное, самые протяженные белки (от 1,5 до 3,5 тыс. ак). Большая часть спидроинов состоит их вырожденных повторов. В связи с таким строением белков все работы по получению рекомбинантных продуктов связаны с конструированием аналогов спидроинов и их экспрессией. Нами был синтезирован олигонуклеотид, кодирующий 134 ак (это 5 выбранных нами повторов из повторяющейся последовательности спидроина 1). Далее этот «мономер» названный 1D был олигомеризован в 1d2, 1d4, 1d8, содержащие 800, 1600 и 3200 пар нуклеотидов соответственно. Эти синтетические гены были клонированы в E.coli, но добиться их стабильной и значительной экспрессии не удалось. Заметные уровни экспрессии были достигнуты в дрожжах S.cerevisiae под контролем GAL-1-зависимого промотора. До 80% белка было обнаружено в нерастворимой форме внутри дрожжевых клеток. Был разработан метод солюбилизации (6M мочевина) и очистки белка. В лучших опытах удавалось получить до 10 мг белка с 1 л ферментационного объема [1].
В ходе этой работы был преодолен ряд трудностей, возникающих при работе с фибриллярными белками. Был разработан метод окрашивания рекомбинантных белков в гелях, так как они очень слабо окрашиваются стандартным красителем – кумасси. Метод включает комбинированное окрашивание красителем амидовым черным и серебром. Были получены поликлональные и моноклональные антитела к синтезированному нами аналогу спидроина 1.
В совместной работе с лабораторией, возглавляемой проф. Э.С. Пирузян (Институт общей генетики РАН им. Н.В. Вавилова), была показана возможность экспрессии исследуемых генов в растениях табака. Использовались гены 1f5 и 1f9 (это гены, полученные присоединением мономера 1D к тетрамеру 1D4 и октамеру 1D8). К этим генам были присоединены с 3'-конца в рамке считывания репортерные гены лихеназы. После трансформации растений было показано, что сконструированные гены интегрированы в геном растений в одной копии (гибридизация по Саузерну). В экстрактах листьев показано наличие полноразмерных гибридных белков (Вестерн блот + зимограммы). Репортерный белок лихиназа сохраняет в гибридных белках ферментативную активность и после электрофореза в ПАГ, содержащим лихенин и инкубации гелей на месте полос, содержащих гибридные белки, появляются полосы, не содержащие лихенина, что детектируется прокрашиванием гелей (зимограмма). Гибридные белки экспрессированы под контролем сильного промотора 35S РНК вируса цветной капусты. Максимальный уровень экспрессии составил 0,7% от суммарного белка [2]. Нужна дальнейшая работа по созданию трансгенных растений, которые удобно возделывать и в которых бы рекомбинантные белки экспрессировались бы в большом количестве. Полученные нами уровни экспрессии мало отличаются от уровней приведенных в патентной заявке 2003 г. фирмы “Dupont de Nemours” (максимум 0,24% от сухого веса семян Арабиодопсис) [3].
С целью повышения выхода рекомбинантного белка мы клонировали ген 1f9 под контролем метанолиндуцибельного промотора АОХ1 в интеграционном дрожжевом векторе -плазмиде pHIL-D2 в клетки метилотрофных дрожжей Pichia pastoris GS115. Отработаны методы культивирования и индукции синтеза рекомбинантного белка, методы очистки белка до гомогенного состояния. Выход очищенного белка составляет 70-100 мг на 1 кг влажной биомассы.
Получение нитей (прядение) представляет отдельную научно-технологическую проблему. Необычным является уже то, что спидроины - очень гидрофобные белки существуют в железах паука в водном растворе при концентрации 30-40%. Экспериментально установлено, что прядение возможно только из концентрированных растворов, содержащих не менее 20% белка. Нами экспериментально подобран состав прядильного раствора – это 60% водный раствор роданида натрия и концентрированная уксусная кислота в соотношении 8:2. Концентрации белка в прядильном растворе 15-30%. Этот раствор через специальное устройство (спинарет) выдавливается в осадитель (96% спирт). Нити затем подвергались вытягиванию, пластификации, отжигу. Сформированные нити характеризуются значениями относительной разрывной нагрузки в 10-15 сН/текс и эластичностью 5-15%. Сочетание этих свойств соответствует энергии разрыва в 9-11 MJ/м3, что в 1,2-1,5 раза превышает аналогичные значения для сухожилий и в 2,3-2,8 раз для костей [4].
В настоящее время ведутся работы по клонированию, очистке и экспрессии аналога второго белка каркасной нити – спидроина 2. Если при выборе повторов взятых для конструирования аналога спидроин 1 мы опирались, в основном, на интуитивные соображения, то при выборе конструкции спидроина 2 мы попытались выбрать научные критерии. Методами биоинформатики мы проанализировали аминокислотые последовательности известных спидроинов и обнаружили определенную периодичность по длине цепи [5]. Аналог спидроина 2 создан с учетом этой периодичности. Не исключено, что эта периодичность является кодом распознавания при укладке молекул белка в нить.
За последние 3 года на рынке появились рекомбинантные белки паутины фирмы “Naxia” (Канада) под торговой маркой Bio Streel™ и фирмы “Protein Polymer Technologies” (США, Калифорния) под торговой маркой ProNectinF и десятки патентов по применению этих белков в различных медицинских изделиях – стентах для балонотерапии артериосклероза, зубных нитях, пленках для рано заживления, различных инплантантах [6,7,8]. Поле деятельности в этой области достаточно обширно. Нам хотелось бы найти партнеров, которые обладали бы опытом в создании медицинских изделий и мы готовы поставлять им материал. Мы также были бы рады сотрудничеству в области исследования механизмов формирования нитей и пленок. Силовая микроскопия, просвечивающая электронная микроскопия и другие методы были бы здесь полезны.
Литература
1. Богуш В.Г., Сидорук К.В., Молчан О.К. и др. Биотехнология 2001, № 2, стр. 73-80
2. Пирузян Э.С., Богуш В.Г., Голденкова И.В. и др. Молекулярная биология, 2003, 37, № 4, стр. 1-9
3. US Patent Application 20030192077
4. Богуш В.Г., Сазыкин А.Ю., Давыдова Л.И. и др. Биотехнология, 2006, № 4 (принята в печать)
5. Рагулина Л.Е., Макеев В.Ю., Есипова Н.Г. и др. Биофизика 2004, 49, вып. 6, стр.1053-1060
6. US Patent Application 20060030927 «Стенты для балонотерапии артериосклероза»
7. US Patent Application 20050283255 «Использование паучьего шелка в инплантантах»
8. US Patent Application 200400224406 «Иммунонейтральные медицинские устройства основанные на нитях шелка»