Возможность доставки актиномицинов к ДНК шпилечными олигонуклеотидами и кофеиновыми кластерами

 

М.А. Битехтина, И. В. Савинцев, А.Э. Ковалев, Н. Л. Векшин

 

Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, Московская область, 142290

 

На примере актиномицинов изучена возможность доставки антибиотиков к ДНК с помощью шпилечных олигонуклеотидов и кластеров кофеина. Обнаружено «переползание» 7-амино-актиномицина со шпильки HP1 на ДНК в растворе и клетке. Показана большая эффективность проникновения антибиотика в клетку в виде комплекса с HP1.

 

Введение

Актиномицины являются эффективными антибактериальными и противоопухолевыми лекарствами. Типичный их представитель актиномицин D (AMD) состоит из феноксазонового хромофора и двух пептидо-лактонных колец. Биологическая активность  этого антибиотика обусловлена его встраиванием в ДНК, ведущим к ингибированию РНК-полимеразной реакции, синтеза белка и клеточного деления. Поскольку AMD плохо проникает в клетки сквозь цитоплазматическую мембрану, возникает проблема его доставки. Известно, что AMD и его флуоресцирующий аналог 7-амино-актиномицин D (7AAMD) могут с высоким сродством (>10⁶ M^-1) связываться с синтетическими шпилечными олигонуклеотидами, например, со шпилькой HP1 d(5'-AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3'). В случае 7AAMD это приводит к усилению флуоресценции. Наибольшее различие интенсивности флуоресценции свободного и связанного 7AAMD наблюдается при возбуждении на "красном" краю спектра поглощения и детекции в "синей" области спектра излучения. Целью данной работы было изучение возможности использования шпилек типа HP1 в качестве молекулярных переносчиков актиномициновых антибиотиков к растворенной ДНК и к ядерной ДНК опухолевых клеток (асцитная карцинома Эрлиха).

 

Результаты

Кинетика связывания актиномицинов с HP1 в миллисекундном диапазоне регистрировалась на установке по измерению флуоресценции "stopped-flow" (Applied Photophysics, UK) при возбуждении 550 нм и эмиссии >570 нм. Кинетические кривые аппроксимировались по методу Гаусса-Ньютона в 3-х экспоненциальном приближении с помощью пакета Matlab 4.0 (MathWorks, Inc.). Время формирования комплекса между 7AAMD и HP1 при 26°C составляло всего 0.3 с (Табл. 1). Медленная компонента при этом отсутствовала.

 

Таблица 1. Интенсивность флуоресценции 7AAMD в HP1 и разных ДНК.

Примечание: концентрация 7AAMD 1 mM. Буфер - 20 мМ трис-HCl (pH 7.5). Концентрация ДНК и HP1 - 0.014 мг/мл. Возбуждение - 570 нм, эмиссия - 610 нм.

AMD и 7AAMD конкурируют за место связывания внутри шпильки HP1. Причем, процесс замещения происходит за доли секунды. Чтобы изучить конкуренцию между 7AAMD и AMD за динамическую "полость" внутри шпильки, к комплексу 7AAMD/HP1 был добавлен избыток AMD. Добавление AMD приводило к мгновенному падению флуоресценции комплекса 7AAMD/HP1 (Табл. 2). 7AAMD способен за 0.3 с замениться в шпильке на AMD. Это время совпадает со временем связывания 7AAMD. Значит, при замене 7AAMD в шпильке на AMD (и наоборот) энергетический барьер отсутствует. Сходная, но гораздо менее выраженная, конкуренция между 7AAMD и AMD наблюдалась при их связывании с ДНК (Табл. 2). В отличие от HP1, где есть лишь одно место связывания, в ДНК имеется много таких мест. Хромофоры 7AAMD и AMD при комплексообразовании находятся внутри ДНК или HP1 в гидрофобном окружении, сходном по физико-химическим свойствам с окружением 7ААМД в пиридине. Причем, встраивание актиномицинов происходит не на поверхности, а в динамической "полости" между двумя цепочками нуклеотидов, но без стэкинга с ними. Вероятно, именно поэтому актиномицины не являются канцерогенами (в отличие от этидиум бромида, интеркалирующего между основаниями ДНК по стэкинговому типу).

 

Таблица 2. Быстрая и медленная компоненты связывания 7AAMD и AMD с HP1 и lДНК.

 

Образец:	t1 (s)	t2 (s)	a2/a1
7AAMD + HP1	0.3	-	-
7AAMD/HP1 + AMD	0.3	-	-
7AAMD  + lДНК	4.6	40	0.3
7AAMD/HP1  + lДНК	4.5	101	1.7
7AAMD/HP1  + NаCl + lДНК	4.9	147	3.5

Примечание: Концентрация 7AAMD - 1 mM, HP1 - 2.4 mM (0.021 мг/мл), lДНК - 0.014 мг/мл, NaCl - 50 мМ. Буфер - 20 мМ трис-HCl с 1 мМ ЭДТА (pH 7.5). Возбуждение 570 нм, эмиссия 610 нм. В ряде опытов stopped-flow концентрация 7AAMD была 2 mM, HP1 - 10 mM, AMD - 10 mM; возбуждение 550 нм, эмиссия > 570 нм.

Кинетика встраивания 7AAMD или AMD в ДНК имеет бифазный характер: наблюдаются быстрая и медленная компоненты; в наших условиях это, соответственно, 4.6 и 40 с (Табл. 1). Быстрая компонента имеет втрое большую амплитуду, чем медленная (a2/a1 = 0.3). Быстрая компонента соответствует связыванию 7AAMD внутри «разрыхленных» мест или петель (грубо говоря, - шпилечно-подобных участков), а медленная - встраиванию 7AAMD в двойную спираль или (и) связыванию 7AAMD с медленно возникающими динамическими одноцепочечными участками, которые появляются в ДНК благодаря тепловым флуктуациям, особенно – при низкой ионной силе. Длительность первой компоненты в случае ДНК оказалась во много раз больше, чем в случае HP1 (Табл.1). Это обусловлено тем, что шпилечнообразные участки и петли ДНК имеют достаточно компактную и жесткую структуру, а шпилька HP1 - гибкая, "рыхлая", со свободными концами.

Флуоресценция 7AAMD возрастает при связывании с HP1 гораздо сильнее, чем при связывании с разными видами нативной ДНК (Табл. 2). Тушение нуклеотидами флуоресценции 7ААМD в ДНК происходит намного эффективнее, чем в HP1. Это позволяет наблюдать процесс перераспределения 7AAMD из комплекса с HP1 на ДНК после добавления избытка ДНК к комплексу 7AAMD/HP1. Медленное "переползание" 7AAMD с HP1 на ДНК в минутном диапазоне регистрировалось нами на спектрофлуориметре Perkin-Elmer MPF при возбуждении 570 нм и эмиссии при 610 нм в 1-см кварцевых кюветах при 20° C спустя 6.0 с после смешивания раствора комплекса 7АAMD/HP1 с избытком ДНК. Процесс "переползания" состоит из быстрой фазы - 4.5 с (она детектировалась на stopped-flow флуориметре) и медленной фазы - 101 с; соотношение амплитуд a2/a1 = 1.7 (Табл. 1), т.е. амплитуда медленной компоненты заметно выше. Чем больше добавлялось ДНК, тем быстрей шел процесс. Две компоненты соответствуют двум типам участков ДНК. Первый тип - это петли и расплетения, а второй - нативная двойная спираль или медленно возникающие динамические расплетения. Увеличение ионной силы  (50 мМ NaCl) приводило к 1.8-кратному уменьшению амплитуды быстрой компоненты, в то время как амплитуда медленной изменялась незначительно. Ионная сила контролирует скорость перераспределения 7AAMD от HP1 к ДНК благодаря тому, что при высокой ионной силе ДНК, как известно, имеет менее "рыхлую" структуру.

Наши опыты in vitro позволяют предположить, что актиномицины in vivo смогут легко проникать к ДНК опухолевых клеток, предварительно связавшись со шпилечными олигонуклеотидами, выполняющими функции  переносчиков.

С помощью люминесцентной микроскопии мы исследовали места локализации антибиотика в клеточных структурах после инкубации клеток асцитной карциномы Эрлиха в течение суток со свободным 7AAMD или с комплексом 7AAMD/HP1. Было обнаружено, что в случае свободно добавленного 7AAMD антибиотик аккумулируется в плазматической мембране клеток. В случае же применения комплекса 7AAMD/HP1 наблюдается интенсивное тотальное прокрашивание антибиотиком ядерных структур клеток (анализ локализации 7AAMD в клетках проводили на микроскопе “ЛЮМАМ” при 900-кратном увеличении, флуоресценция регистрировалась в диапазоне 600-700 нм).

Цитотоксическое воздействие актиномициновых комплексов мы изучали на клетках карциномы Эрлиха. Клетки карциномы выделяли из брюшной полости мышей в питательную среду RPMI (pH 7.5). Клеточную суспензию разбавляли до 0,5 миллионов клеток в 1 мл. Комплекс AMD/HP1 или 7AAMD/HP1 в мольном соотношении 1:1 (в водном растворе) добавляли при перемешивании в клеточную среду до конечной концентрации 10 мкМ. Клетки инкубировали в такой среде в течение суток при 37°С. Смертность клеток определяли на микроскопе “ЛЮМАМ” в проходящем свете при прокрашивании 10 мкМ трепановым синим.

Добавка AMD в питательную среду вызывала лишь небольшое увеличение гибели клеток по сравнению с контролем (без AMD). Это связано с тем, что AMD плохо проникает внутрь клеток. При инкубации в присутствии комплекса AMD/HP1 гибель клеток возрастала в несколько раз. При этом  цитотоксичность самого HP1 в отношении карциномы была сравнима с цитотоксичностью свободного AMD и не превышала 6% (это за вычетом спонтанной гибели клеток в контроле). Итак, HP1 существенно потенцирует действие AMD. Это можно объяснить не только способностью HP1 переносить актиномицины к ДНК, но также высокой плотностью упаковки олигонуклеотида в комплексе с антибиотиком, что создает условия для эффективного переноса через мембраны клетки. Устойчивость комплекса способна обеспечить его прохождение как через плазматическую, так и ядерную мембрану. Полученные результаты дают основание рассматривать олигонуклеотидные шпильки как хорошие трансмембранные переносчики актиномициновых антибиотиков к ДНК опухолевых клеток.

Противоположный результат был получен на клетках карциномы для комплекса с ДНК (вместо HP1): никакого усиления действия антибиотика не наблюдалось, напротив, гибель клеток даже несколько уменьшалась. В этих экспериментах использовались комплексы AMD или 7AAMD с тимусной ДНК; концентрация антибиотика составляла 10 мкМ, а концентрация нуклеотидов ДНК - 200 мкМ.

Как известно, в актиномициновой терапии для наступления первоначальных лечебных эффектов необходим период не менее суток. Результаты нашего модельного эксперимента на клетках (с периодом инкубации 1 сутки) позволяют высказать предположение о том, что использование комплексов антибиотиков со шпильками может интенсифицировать терапию и снизить побочное токсическое действие антибиотиков (которое в случае AMD связано с его действием на мембраны через образование супероксида).

Другим переносчиком антибиотиков могут служить пуриновые кластеры, например, кластеры кофеина, образующиеся в воде спонтанно при миллимолярных концентрациях. При изучении спектров поглощения кофеина разных концентраций мы наблюдали уменьшение коэффициента экстинкции при увеличении концентрации кофеина. Гипохромный эффект проявлялся при концентрациях выше 1 мМ. Степень гипохромизма достигала максимального значения - 27 % - при 8 мМ концентрации кофеина. Согласно модели экранировочного гипохромизма (Vekshin N.L. 2002), при формировании упорядоченной структуры молекул размерами меньше длины волны возникает взаимная конкуренция хромофоров за фотон, что ведет к уменьшению измеряемого коэффициента экстинкции, причем, по величине гипохромного эффекта можно судить о числе молекул, образующих данную структуру (кластер). При e _{КОФЕИНА} = 9740 М^-1 см^-1 (при 273 нм) и степени гипохромизма 0,27 число кластерных молекул кофеина, вычисленное нами по экранировочной модели, составило 8-12 (в зависимости от их взаимной ориентации в кластере). При добавлении AMD к кластерам кофеина, коэффициент экстинкции последнего увеличивается, что дает основания предполагать существование сильного взаимодействия между кластерами кофеина и молекулами антибиотика, снижающего упорядоченность структуры. При добавлении 7AAMD к кластерам кофеина наблюдалось увеличение интенсивности флуоресценции 7AAMD и заметное изменение его спектра возбуждения. Отсутствие существенного сдвига спектра эмиссии 7AAMD в кофеиновых кластерах, а также наличие тушения его флуоресценции добавляемым динитрофенолом указывают на поверхностное связывание антибиотика.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1.                  Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Мол. биол. 2002. Т.36. С. 725-730.

2.                  Vekshin N., Savintsev I., Kovalev A., Yelemessov R., Wadkins R..// J. Phys. Chem.:B. 2001. V. 105. P. 8461-8467.

3.                  Vekshin N.L. Photonics of Biopolymers. Springer, Berlin, 2002.

4.                  Савинцев И.В., Векшин Н.Л. Формирование комплексов актиномицинов с ДНК в растворах и пленках // Прикл. биохимия и микробиол., 2004, т.40, N 4, с.421-428.

5.                  Ковалев А.Э., Яковенко А.А., Векшин Н.Л. // Биофизика. 2004, Т. 49. С. 1030-1037.